枯草蛋白酶E的定点突变及其对酶性质的影响
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表! 枯草蛋白酶 * 突变体水解+ , ’ ’ . , C 2 D 的反应动力学常数 % 1 2 3 4 ! 5 6 7 4 8 6 9 9 : 7 + 8 1 7 8 + ; : <= ? < : 3 + 6 + : ; + , ’ ’ . , C 2 D > > 2 6 3 ? , 8 4 1 7 ?A 1 < 6 1 7 8 + : ; + B 2 8 6 3 6 + 6 7* >@ > /
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$ 及枯草芽孢杆菌 大肠杆菌穿梭质粒 E K ! % 4! 0 K 9 0 P ［ ］ ! # $ 来源于中国科学院生物物理研究所朱榴琴实验 ［ ］
本文借鉴 A 用定点突 ? H 7 ; ) ; I 2变体酶的研究经验， = ／ 变的方法考虑 A $ $ ! B C $ $ & D 突变对枯草蛋白酶 9 性质的影响， 为将枯草蛋白酶 9 进一步改造成非水 介质中稳定的多肽连接酶打下基础。
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! 方法
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收稿日期： ， 修回日期： 。 ! / / / 0 % # 0 ! & ! / / / 0 ! $ 0 % # ） 。 基金项目： 国家高技术研究与发展计划项目资助 （ ! % # 0 ! $ 0 % $ 0 % $ ： ； ： ； ： "通讯联系人： 1 2 ) 3 " $ ! 0 " 4 5 % % 3 / $2 6 7 * # 5 ! 8 6 3 " $ ! 0 " 4 5 % % $ 4 4 9 0 : ; ) ( < > ? < !> ( 7 : ; ) * @ ( : . = . =
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摘
要
枯草芽孢杆菌蛋白酶是重要的工业用酶， 对其 结构功能的理解及催化机理的研究已比较透彻， 目 前有关枯草杆菌蛋白酶以及变体酶的研究已超出水 解 性 质 的 范 畴， 而拓展到多肽合成的应用研
［ ］ ! " # ， 但是枯草蛋白酶催化酰胺水解的效率高， 究
" 材料
" # " 酶和试剂 除测序用 1 5A 2 ? 2 < @ ; < ; 7为 C > N : @ ; -公司 L =M 产品外， 实验所用酶及突变试剂盒 D ) 7 2 N 2 OA ; 7 2 N#
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枯草蛋白酶 ! 的定点突变及其对酶性质的影响
杨永华 蒋 岚 杨胜利"
（中国科学院上海生物工程研究中心 上海 $ ） % % $ # #
吴宇杰 朱榴琴
（中国科学院生物物理研究所 北京 ! ） % % ! % !
用定点突变的方法研究 A ／ ／ ／ ／ ／ ／ ／ $ $ ! B C $ $ & D， + ! ! 3 A A $ $ ! B C $ $ & D， E " % + A $ $ ! B C $ $ & D和 F ! % # G A $ $ ! B 酯酶活性与蛋白酶活性之比的影响。结果表明： ／ C $ $ & D 突变对蛋白酶活性， A $ $ ! B C $ $ & D 突变使蛋白酶活性比枯 草蛋白酶 9 低5 多倍， 酯酶活性与蛋白酶活性之比是 的 倍； ／ ／ #% % % A ? H 7 ; ) ; I 2 # + ! ! 3 AA $ $ ! B C $ $ & D 突变使蛋白酶 = ／ 酯酶与蛋白酶活性之比下降4倍， 同时增加变体酶 活性和酯酶活性分别比 A $ $ ! B C $ $ & D 突变下降# J "倍和! &倍， 的热稳定性； ／ ／ ／ 突变使蛋白酶活性比 ／ ／ 突变体下降 但对酯酶 E " % ++ ! ! 3 AA $ $ ! BC $ $ & D + ! ! 3 AA $ $ ! BC $ $ & D ! & 倍， 活性几乎没有影响， 酯酶与蛋白酶活性之比增加! 分别是 A ／ 4倍， $ $ ! B C $ $ & D 突变体和 A ? H 7 ; ) ; I 2的# J #倍和! % J # = 倍； 但是， ／ ／ ／ ／ ／ 酯酶活性下降 F ! % # G + ! ! 3 A A $ $ ! B C $ $ & D 突变使蛋白酶活性比 + ! ! 3 A A $ $ ! B C $ $ & D 突变体增加&倍， 酯酶与蛋白酶活性之比下降!% & &倍， % %倍。 ， 定点突变， 蛋白酶活性， 酯酶活性 关键词 枯草蛋白酶 9 中图分类号 F 文献标识码 文章编号 （ ） & / ! J $ D ! % % % 0 # % " ! $ % % % % # 0 % # 4 ! 0 % 4
表# 枯草蛋白酶 * 突变体水解+ , ’ ’ . , 0 ’ / 的反应动力学常数 % 1 2 3 4 # 5 6 7 4 8 6 9 9 : 7 + 8 1 7 8 + ; : <= ? < : 3 + 6 + : ; + , ’ ’ . , 0 ’ > > / 2 6 3 ? , 8 4 1 7 ?A 1 < 6 1 7 8 + : ; + B 2 8 6 3 6 + 6 7* >@ > /
在催化多肽合成的过程中会引起底物及合成产物肽 键的进一步水解， 因此必须对枯草蛋白酶进行改造， 降低酰胺键水解活性； 另一方面， 具有酯酶活性的蛋 白酶可 作 多 肽 合 成 的 催 化 剂， 这样的研究已有许 其是枯草蛋白酶 K ／ C + 经过 A $ $ ! B （A ） 改造后酰胺水解活性大幅度下 C $ $ & D ? H 7 ; ) ; I 2 = ［ ］ 3 降， 但仍保留较高的酯酶活性 ， A ? H 7 ; ) ; I 2变体酶 =
黑体画线部分表示突变碱基； 突变后的质粒分 别命名为 1 ， ， ， 所有突变都 " D $ " D # " D /和 1 " D ? 1 1 经双脱氧链终止法测序证实。用 ! ／ " # B " $ % &C! 切出突变后的片段， 分别插入 1 中得到表达质 2 ! 3 # ， ， 。变体酶 2 ， ， 粒1 2 D $ 2 D # 2 D /和 1 2 D ? D $ 2 D # 1 1 2 D /及 2 D ?都在 + 2 $ ?中得到表达。 ! " ! 表达及纯化 （含卡那霉素 ’ ／ 于 突变菌种在 # D G中 H J） I ／ 。# / K L， # 9 H : <发酵/ -#/ , M J 发酵上清用 ） 沉淀 （/ 后， 溶于$ （) C " N O #, O 饱 和 度） ’ ?# ? ／ ／ J 磷 酸 缓 冲 液（$ H H 8 @ J % 5 % @ H J$ H H 8 @ #， ） ， 直接上 + 用磷酸缓 C K P ? ! ( ! 3 + > Q A 9 5 <( 3 # ’ 柱， 1 冲液 （ ） 缓慢淋洗 （ ／ ） ， C K P ? # H J M " + " 3 & ( F ! 鉴定 1 用磷酸 所需蛋白， 超滤浓缩后上 ( R 9 @ > Q& 3 $ ’ - 柱， 7 缓冲液 （1 ） 缓慢淋洗， 得到电泳纯 （S 的变 C K P ? ’ O） 体酶。变体酶的浓度根据# 以消 * < H 处的 ’ ( 值， 光系数) $ $ P K计算。 $ R H， $ OT ［ ］ ! " ( 动力学性质测定 ) 测定蛋白酶活性时， 用四肽底物 6 3 ( ( & U 3 ) ( 1 （溶 于 $ ／ ， ／ C K P ? -H H 8 @ J 磷 酸 缓 冲 液， $H H 8 @ J 1 ， / K L， ? $ < H 处测定蛋白酶活性及底 % 5 % @ # 溶液） 物浓度与酶活的关系， 计算不同底物浓度时的初速 （表$ ） 。 度。算出 *H， * R 5 A 测定酯酶活性时， 用四肽底物 6 （溶 3 ( ( & U 3 " V W
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