从淡水生态系统中分离出的丝状真菌

从淡水生态系统中分离出的丝状真菌

对Cu和Pb的耐受性和生物吸附性

【摘要】：丝状真菌可以从周围环境中积累大量的金属，他们作为生物吸附剂从污染沉积物中吸附重金属的潜力正在引起人们的关注。在本研究中，根据真菌对Cu和Pb的耐受性和吸收能力，将从马来西亚雪兰莪州冷岳河的沉积物中分离出41种丝状真菌菌株进行了筛分。这些菌株被鉴定为黑曲霉、烟曲霉、棘胞木霉、简青霉、微紫青霉。黑曲霉和简青霉都可以在Cu(II)浓度为1000 mg/L的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上存活，而只有黑曲霉能在Pb浓度为5000 mg/L的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上存活。结果表明，相对于Cu，黑曲霉、简青霉、棘胞木霉对Pb具有更好的吸收能力，并指出丝状真菌有希望从水溶液中吸附Cu和Pb。本研究还确定了黑曲霉对Cu(II) 和 Pb(II)的最大去除率，对Cu的最大去除率出现在Cu(II)浓度为 200 mg/L时，去除率为(20.910±0.581) mg/g，对Pb的最大去除率出现在Pb (II)浓度为 250 mg/L 时，去除率为(54.046±0.328) mg/g。

【关键字】：生物吸附，铜，铅，黑曲霉，简青霉，棘胞木霉

引言

随着工业活动和技术发展的影响，越来越多的重金属进入到环境，并对环境构成严重威胁，公共与土壤健康(Zafar等2007)。由于对重金属的应用不断增加和他们难以改变的性质，重金属污染自然成为最严重的环境问题之一。

随着工业活动和技术的发展，重金属包括铜和铅不断进入到环境。采矿和金属加工产生的工业废水通常会造成重金属污染（Savvaidis 等, 2003; Anand 等.2006)。目前对传统的从水溶液中去除金属离子的方法已有详细的研究，如化学沉淀、离子交换、电化学处理和膜技术。然而，这些方法效率低，不经济(Wang 和Chen, 2006)。因此，需要发展高效、经济且环保的技术来去除工业废水中的重金属。

生物吸附是指包括利用微生物去除和控制环境污染。最近，在清除污染场地方面它越来越受到关注(Farhadian 等, 2008).通过利用不能发展壮大的微生物包括蓝藻、真菌、细菌。这个替代方法已经被认为是从水溶液中去除重金属和放射性核素的完美方法。(Sar和D’Souza, 2001)。生物吸附是基于生物和非生物系统中微生物和金属离子的相互作用，拥有如运行成本低，从废水中去除低浓度重金属效率高等优点(Kapoor 等, 1999; Fan 等, 2008).

真菌是一个多用途的生物吸附群，它们能够经受极端的pH和温度，养分利用率高，同样也可以经受高的金属浓度(Anand etal., 2006).在其他生物吸附剂中，真菌微生物高组分的细胞壁物质表现出优越的金属结合性。这些微生物已经被用来处理废弃物和净化废水(Singh, 2006).现在真菌微生物的生物修复应用越来越广泛，并得出一大批成果(Lopez和Vazquez, 2003).

在发酵和生物修复行业，丝状真菌已经广泛运用数十年了(Luef 等,1991).

因为他们更容易从液体基质中去除，所以他们优于其他生物体的生物修复。真菌微生物可以用于生物吸附过程，因为它通常对金属和其他诸如低pH表现出明显的耐受性(Gadd, 1990; Zafaret 等, 2007; Kapoor和Viraraghavan, 1997).

在本研究中，根据丝状真菌对不同浓度Cu(II)和Pb(II)的耐受性和吸收能力把从马来西亚雪兰莪州冷岳河的沉积物中分离出的丝状真菌菌株进行筛分。最大吸附能力根据变化的Cu和Pb离子浓度水溶液对应的生物干重来确定。

1 材料和方法

1.1 采样

选择马来西亚雪兰莪州冷岳河中一片被市政和工业废物淹过的开放水系统作为采样区。在此区域用艾克曼挖泥器（美国，野生动物，196型标准艾克曼挖泥器）在5-10cm深处挖取沉积物。沉积物样品装入酸洗的聚乙稀袋中，放入冰箱于3℃下保存。

1.2 真菌分离

取10克沉积物放入锥形瓶，加入100mL无菌蒸馏水配制成储备溶液。溶液置于摇床（Infors-HT，瑞士）以200r/min速度振荡20分钟。随时准备10倍稀释溶液，在10−3用于真菌分离。每个培养皿用吸管先加入1mL土壤溶液，再加入9mL无菌玫瑰孟加拉琼脂（RBA）。培养皿在凝固前用手搅拌，然后在28±2℃下培养四天。每个培养皿上出现的菌落都作好标记，对菌落形成单位(CFU)进行估算，并转移到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上进行再次培养。维护好PDA斜面，保持4℃下的纯培养直到达到进一步研究的要求。

1.3 通过形态特征和内转录间隔区序列鉴别真菌

所有的真菌首先通过它们宏观和微观的特征进行识别。曲霉菌属的鉴别遵循Raper和Fennell(1965)，木霉菌属根据Rifai(1969)，青霉菌属根据Raper等. (1968)。

真菌的鉴定由基于基因序列ITS内转录间隔区核糖体的DNA（rDNA）的分子方法来确定。rDNA的ITS1和ITS2区域通过多聚酶链式反应来扩增，根据 White 等(1990)，通过搜寻工具，将从10个真菌菌株得到的序列数据和ITS序列与基因库（国家生物技术信息中心：）序列进行比对。1.4 耐受性最强真菌的筛选

用CuCl2·5H2O或Pb(NO3)2（分析纯，默克公司）加蒸馏水制备Cu(II)和Pb(II)原溶液。分别取2mLCu(II)原溶液和18mL无菌PDA加入通用瓶获得100，500，800和1000mg/L浓度所需Cu(II)溶液，取2mL Pb(II)原溶液和18mL无菌PDA加入通用瓶获得100，500，1000，2000和5000mg/L浓度所需Pb(II)溶液制备固体培养基。

将混合有Cu(II)和Pb(II)的PDA溶液迅速倒入培养皿，并缓缓搅拌。基质用同一个圆盘（直径5mm的软木穿孔器）接种原真菌培养基边缘的幼菌丝体(Zapotoczny 等, 2006)并且观察10天，每天观察一次。每个菌株重复3次进行筛选。

1.5 所选菌株的毒性试验

将准备好的马铃薯葡萄糖培养液（PDB）和100mL所需浓度（10，25，50，100，150，200，250和300mg/L）的Cu(II) 或Pb(II)原溶液加入250mL的锥形瓶中，用3个圆盘分别接种原固体PDA培养基边缘的幼菌丝体(Zapotoczny 等, 2006).在接种真菌前，每个菌落的 Cu(II) 和Pb(II)初始浓度用电感耦合等离子光谱仪核准(ICP-OES Model Optima 2000DV, PerkinElmer, USA)(Lopez和Vazquez, 2003).培养基在（28±1）℃，200r/min的恒温摇床振荡下培养(Model Multitron, Infors-HT, Switzerland)。

1.6 不同Cu(II)和Pb(II)浓度下的真菌生长的测定

经过七天的培养之后，将培养瓶中收获的不同Cu(II)或Pb(II)浓度下的真菌生物用whatman1号滤纸过滤。生物样品用蒸馏水反复洗涤数次，然后放在大于80℃的温度下烘干，直到重量不在改变，记下重量作为干生物量（g/L）(Anand 等, 2006).

1.7 丝状真菌在不同浓度下对Cu(II)和Pb(II)的去除率

根据Lopez and Vazquez的方法（2003），接种前液体培养基中Cu(II)或Pb(II)的浓度用ICP-OES测定。重金属的吸收量（q,mg/g）用下面的公式计算(Lopez和Vazquez,2003;Zafar等,2007；Fan 等,2008)：

q=[( Ci- Cf)/m]V

式中：q(mg/g)——每克生物量吸收的毫克金属离子量；

Ci(mg/L)——初始金属离子浓度；

Cf(mg/L)——最终金属离子浓度；

m(g)——干生物量；

V——培养液体积。

1.8 数据分析

数据运用SPSS16.0社会科学统计软件进行统计分析。单因素变量分析结果P ≤0.05，表现出显著的差异。并用Duncan事后检验法作比较。

2 结果与讨论

2.1通过形态特征和内转录间隔区序列鉴别真菌

从含有高浓度Cu(44.43μg/g)和Pb(17.28μg/g)的马来西亚雪兰莪州冷岳