实验五 细胞器的分离及纯化
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细胞器的分离、 实验五 细胞器的分离、 ——（细胞分级分离法） 纯化——（细胞分级分离法）
一、实验目的
• 掌握细胞器的分离及纯化的一般原 理和方法。 理和方法。 • 了解用细胞匀浆和差速离心的方法 分级分离细胞组分的原理及过程。 分级分离细胞组分的原理及过程。 • 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
缺点：
优点： 分离效果好，可一次获得较纯粒； 优点：①分离效果好，可一次获得较纯粒； 适应范围广， ②适应范围广，既能分离具有沉淀系差的颗 又能分离有一定浮力密度的颗粒； 粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗 粒不会积压变形，能保持颗粒活性， 粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并止已 形成的区带由于对流而引起混合。 形成的区带由于对流而引起混合。 缺点： 离心时间较长； 需要制备梯度； 缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③ 操作严格，不宜掌握。 操作严格，不宜掌握。
二、实验原理
• 细胞内各种结构的比重和大小都不相同， 细胞内各种结构的比重和大小都不相同， 各种结构的比重和大小都不相同 在同一离心场内的沉降速度也不相同， 在同一离心场内的沉降速度也不相同，根 据这一原理，常用不同介质和不同转速的 据这一原理， 离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 其过程包括组织细胞匀浆、 其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分 析三步，这种方法已成研究亚细胞成分的 析三步， 化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 • 一般采用差速离心或密度梯度离心的方法 一般采用差速离心或密度梯度离心的方法 差速离心 得到分离细胞器。 得到分离细胞器。
常见的离心机
相对离心场
• RCF = 1.119 x 10 ·(rpm) r
• • • RCF表示相对离心场 表示相对离心场 rpm表示离心机每分钟的转数 rpm表示离心机每分钟的转数 r 表示离心机转轴中心与离心管中心的距离
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由于离心管的位置由转（ 由于离心管的位置由转（rotor） ） 决定，因此r 决定，因此 必须由查阅相关 转子的参数而得。 转子的参数而得。
三、实验用品
• 材料：新鲜菠菜 材料： • 器械：显微镜、高速低温离心机、普通离 器械：显微镜、高速低温离心机、 心机、 目的尼龙网、 心机、200目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织 目的尼龙网 漏斗、烧杯、 研磨器等。 研磨器等。 • 试剂：线粒体离心匀浆介质； 试剂：线粒体离心匀浆介质； 0.05M Tris—HCl液体 液体 0.35mol/L NaCl
差速离心法 速
differential centrifugation
速
分离
匀浆
离心 1 000G20分钟 分钟
细胞骨架
细 胞 核 离 心 10 000G 分 钟 20
细胞骨架
差 速 离 心 法
线 核 糖 体 等 离心0.26% 离心 15 000G20分钟 分钟 微 粒 体 离心 15 000G120分钟 分钟 粒 体 等
It's over. Thanks!
↓
过滤液在低温高速离心机上2300rm离心10分钟、弃沉淀 过滤液在低温高速离心机上2300rm离心10分钟、 2300rm离心10分钟
↓
上清液在低温高速离心机上9950rm离心10分钟、弃上清 上清液在低温高速离心机上9950rm离心10分钟、 9950rm离心10分钟
↓
பைடு நூலகம்
所留沉淀用匀浆介质液洗涤，仍以9950rm离心10分钟、 所留沉淀用匀浆介质液洗涤，仍以9950rm离心10分钟、弃上清 9950rm离心10分钟
四、实验方法
1.玉米黄化幼苗线粒体的分离
将玉米黄化幼苗剪下，称约5g，在冰箱中放置1 将玉米黄化幼苗剪下，称约5g，在冰箱中放置1小时 5g
↓
将幼苗剪碎，倒入研钵，1:3比例加入PBS介质， 将幼苗剪碎，倒入研钵，1:3比例加入PBS介质，快速磨碎 比例加入PBS介质
↓
双层尼龙网过滤， 双层尼龙网过滤，出去残渣
• 这个方法包括匀浆化、分级分离、分析三 这个方法包括匀浆化、分级分离、 个步骤。 个步骤。
• 匀浆化 ： 在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破碎。 在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破碎。 这就是细胞匀浆化， 这就是细胞匀浆化，而破碎物为细胞匀浆 。 • 分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、密度等的不同 分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、 来将其分离。 来将其分离。 • 分析 对用这样方法得到的各分离物进行化学分析， ： 对用这样方法得到的各分离物进行化学分析， 可以大大丰富细胞各种组分的结构和机能的知识。 可以大大丰富细胞各种组分的结构和机能的知识。
密度梯度离心法 density gradient centrifugation method 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，
颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
↓
将所得沉淀悬浮于0.5M、pH7.2甘露醇中， 将所得沉淀悬浮于0.5M、pH7.2甘露醇中，置冰箱备用 0.5M 甘露醇中
↓
将制备的线粒体悬液滴于干净载玻片上， B的0.25M蔗糖液染 将制备的线粒体悬液滴于干净载玻片上，用1%Janus Green B的0.25M蔗糖液染 色20min
↓
加上盖玻片，最好用相差显微镜镜检，观察。 加上盖玻片，最好用相差显微镜镜检，观察。
2.菠菜叶叶绿体的分离
取去叶脉的新鲜菠菜5g于研钵内，加入 取去叶脉的新鲜菠菜 于研钵内，加入0.35mol/L NaCl 15ml研磨 于研钵内 研磨 ↓ 绿色的匀浆液用尼龙网（ 绿色的匀浆液用尼龙网（200目）过滤，滤液分别转入两只干净的离心 目 过滤， 管 ↓ 1000rpm离心 离心4min，除去沉淀 ， 离心 ↓ 上清液在高速低温离心机上以3000rpm离心 离心5min，所得沉淀即为叶绿体 上清液在高速低温离心机上以 离心 ， ↓ 液稀释， 用0.35mol/L NaCl液稀释，置冰箱中保存备用 液稀释 ↓ 在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片， 在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片，于显微镜下观察
一、实验目的
• 掌握细胞器的分离及纯化的一般原 理和方法。 理和方法。 • 了解用细胞匀浆和差速离心的方法 分级分离细胞组分的原理及过程。 分级分离细胞组分的原理及过程。 • 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
缺点：
优点： 分离效果好，可一次获得较纯粒； 优点：①分离效果好，可一次获得较纯粒； 适应范围广， ②适应范围广，既能分离具有沉淀系差的颗 又能分离有一定浮力密度的颗粒； 粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗 粒不会积压变形，能保持颗粒活性， 粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并止已 形成的区带由于对流而引起混合。 形成的区带由于对流而引起混合。 缺点： 离心时间较长； 需要制备梯度； 缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③ 操作严格，不宜掌握。 操作严格，不宜掌握。
二、实验原理
• 细胞内各种结构的比重和大小都不相同， 细胞内各种结构的比重和大小都不相同， 各种结构的比重和大小都不相同 在同一离心场内的沉降速度也不相同， 在同一离心场内的沉降速度也不相同，根 据这一原理，常用不同介质和不同转速的 据这一原理， 离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 其过程包括组织细胞匀浆、 其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分 析三步，这种方法已成研究亚细胞成分的 析三步， 化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 • 一般采用差速离心或密度梯度离心的方法 一般采用差速离心或密度梯度离心的方法 差速离心 得到分离细胞器。 得到分离细胞器。
常见的离心机
相对离心场
• RCF = 1.119 x 10 ·(rpm) r
• • • RCF表示相对离心场 表示相对离心场 rpm表示离心机每分钟的转数 rpm表示离心机每分钟的转数 r 表示离心机转轴中心与离心管中心的距离
-5 2
由于离心管的位置由转（ 由于离心管的位置由转（rotor） ） 决定，因此r 决定，因此 必须由查阅相关 转子的参数而得。 转子的参数而得。
三、实验用品
• 材料：新鲜菠菜 材料： • 器械：显微镜、高速低温离心机、普通离 器械：显微镜、高速低温离心机、 心机、 目的尼龙网、 心机、200目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织 目的尼龙网 漏斗、烧杯、 研磨器等。 研磨器等。 • 试剂：线粒体离心匀浆介质； 试剂：线粒体离心匀浆介质； 0.05M Tris—HCl液体 液体 0.35mol/L NaCl
差速离心法 速
differential centrifugation
速
分离
匀浆
离心 1 000G20分钟 分钟
细胞骨架
细 胞 核 离 心 10 000G 分 钟 20
细胞骨架
差 速 离 心 法
线 核 糖 体 等 离心0.26% 离心 15 000G20分钟 分钟 微 粒 体 离心 15 000G120分钟 分钟 粒 体 等
It's over. Thanks!
↓
过滤液在低温高速离心机上2300rm离心10分钟、弃沉淀 过滤液在低温高速离心机上2300rm离心10分钟、 2300rm离心10分钟
↓
上清液在低温高速离心机上9950rm离心10分钟、弃上清 上清液在低温高速离心机上9950rm离心10分钟、 9950rm离心10分钟
↓
பைடு நூலகம்
所留沉淀用匀浆介质液洗涤，仍以9950rm离心10分钟、 所留沉淀用匀浆介质液洗涤，仍以9950rm离心10分钟、弃上清 9950rm离心10分钟
四、实验方法
1.玉米黄化幼苗线粒体的分离
将玉米黄化幼苗剪下，称约5g，在冰箱中放置1 将玉米黄化幼苗剪下，称约5g，在冰箱中放置1小时 5g
↓
将幼苗剪碎，倒入研钵，1:3比例加入PBS介质， 将幼苗剪碎，倒入研钵，1:3比例加入PBS介质，快速磨碎 比例加入PBS介质
↓
双层尼龙网过滤， 双层尼龙网过滤，出去残渣
• 这个方法包括匀浆化、分级分离、分析三 这个方法包括匀浆化、分级分离、 个步骤。 个步骤。
• 匀浆化 ： 在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破碎。 在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破碎。 这就是细胞匀浆化， 这就是细胞匀浆化，而破碎物为细胞匀浆 。 • 分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、密度等的不同 分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、 来将其分离。 来将其分离。 • 分析 对用这样方法得到的各分离物进行化学分析， ： 对用这样方法得到的各分离物进行化学分析， 可以大大丰富细胞各种组分的结构和机能的知识。 可以大大丰富细胞各种组分的结构和机能的知识。
密度梯度离心法 density gradient centrifugation method 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，
颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
↓
将所得沉淀悬浮于0.5M、pH7.2甘露醇中， 将所得沉淀悬浮于0.5M、pH7.2甘露醇中，置冰箱备用 0.5M 甘露醇中
↓
将制备的线粒体悬液滴于干净载玻片上， B的0.25M蔗糖液染 将制备的线粒体悬液滴于干净载玻片上，用1%Janus Green B的0.25M蔗糖液染 色20min
↓
加上盖玻片，最好用相差显微镜镜检，观察。 加上盖玻片，最好用相差显微镜镜检，观察。
2.菠菜叶叶绿体的分离
取去叶脉的新鲜菠菜5g于研钵内，加入 取去叶脉的新鲜菠菜 于研钵内，加入0.35mol/L NaCl 15ml研磨 于研钵内 研磨 ↓ 绿色的匀浆液用尼龙网（ 绿色的匀浆液用尼龙网（200目）过滤，滤液分别转入两只干净的离心 目 过滤， 管 ↓ 1000rpm离心 离心4min，除去沉淀 ， 离心 ↓ 上清液在高速低温离心机上以3000rpm离心 离心5min，所得沉淀即为叶绿体 上清液在高速低温离心机上以 离心 ， ↓ 液稀释， 用0.35mol/L NaCl液稀释，置冰箱中保存备用 液稀释 ↓ 在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片， 在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片，于显微镜下观察