苯酚硫酸法测总糖

苯酚-硫酸法

1. 原理

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

2. 试剂

浓硫酸

6%苯酚：

先配置80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。再配置6%苯酚：取75ul的80%苯酚于烧杯中，加入960ul

水（每次测定均需现配）。

3. 操作步骤

(1) 制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

(2) 样品含量测定：

吸取1.0ml样品，补水至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却室温放置30分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。

注意事项:

1、苯酚是否重蒸、其溶液浓度、是否现配现用

2、加入硫酸后是否加热、显色时间的确定

3、所选波长：这个最为重要，因为已糖及其甲基化衍生物在490nm下有最大吸收峰，而戊糖、糠醛酸及其甲基化衍生物在480nm下有最大吸收峰。如果阁下的多糖样品不是单一品而是数种混合（纯化也难一达到100%纯），则波长一定要扫描过再做

4、加浓硫酸前要摇匀，加之后也要摇匀。

（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。

（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算

（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。（5）正常的反应溶液是深棕色。糖越多颜色越深。注意硫酸的纯度。空白的颜色很深，说明你的空白中的苯酚被氧化了深红是醌（苯酚氧化生成）的颜色颜色过深的话说明苯酚的浓度过大。

操作的时候有几条你需要注意的，这些对你的检测结果影响极大

1、苯酚需要重蒸，配制的苯酚溶液需要妥善保存。

2、样品检测的时候，向样品中加了苯酚溶液需要迅速摇匀，加入硫酸基本操作：硫酸沿壁加，最好能旋转比色管，让硫酸能均匀的沿壁流下。

3、加完硫酸需要立即摇匀，前提是塞子要配套，不怕烫热、冷水浴，要准确。