菌株选育

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1、工业微生物育种是建立在遗传和变异的基础上的，没有变异，生物界将失去进化的素材；没有遗传，变异也无法积累。通过菌种的选育我们可以提高产品的产量和质量。

2、杂交育种的主要目的在于把不同菌株的优良经济性状集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的上述缺陷，同时杂交还是增加产品新品种的手段之一。

3、紫外线的光谱范围在40～390nm，DNA可以吸收的紫外线光谱为260nm。15W紫外灯管放射出来的紫外线大约有80%的波长集中在这个范围内，诱变效应比30W的好。

4、紫外线的辐射剂量：紫外线的诱变剂量可分绝对剂量和相对剂量。

5、诱变剂包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三大类。

6、用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等，氯化锂比较常用。

7、菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离和鉴定几个步骤。

8、放线菌的杂合技术：方法有混合培养法、玻璃纸法和平板杂交法等。

9、基因组改组育种特点：基因组改组育种技术不仅具有高效性和定向性，更具有了理性化、通量化和自动化的特点。

10、基因组改组育种技术的特点：传统原生质体融合是两个亲本单轮融合，基因组改组是多亲本多轮融合。

11、与传统育种方法不同的是，基因工程育种能实现真正意义上的远缘杂交。

12、质粒载体的选择标记：常用的标记是抗生素抗性基因。λ噬菌体载体接受外源DNA的能力要比细菌质粒大得多，其最大接受容量可达23kb。柯斯质粒就是这类专门用来克隆大DNA片段的人工构建的新载体。

13、DNA的制备：制备完整、纯净、高质量的DNA，是基因工程首要和关键环节。

14、以微生物原生质体为材料的常用的育种方法主要有原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原生质体转化育种和原生质体融合育种。无论那种原生质体育种方法，我们都要在菌种对数生长期时，进行菌种原生质体的制备。





名词

1、诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质，称为诱变剂。

2、助诱变剂：单独使用没有明显的诱变效果，常与其它诱变配合处理。

3、物理诱变剂：是通常使用物理辐射中的各种射线，较广泛的是紫外线、X射线、γ射线和快中子。物理辐射分为电离辐射和非电离辐射，都是以量子为单位的可以发射能量的射线

4、化学诱变剂：是一类能对DNA起作用、改变其结构、并引起遗传变异的化学物质。

5、碱基类似物：是一类和天然的嘧啶嘌呤等四种碱基分子结构相似的物质，是一种既能诱发正突变，也能诱发回复突变的诱变

剂。

6、菌株分离：是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。

7、嗜热菌：是一种耐高温的需氧或厌氧菌，在分离嗜热菌时，往往为了防止固体平板水分蒸发过快，使培养基破裂，可以通过增加培养平板的厚度和增加培养基中琼脂的含量来降低水分的蒸发。

8、酶合成的调节：是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制，这是一种在基本水平上的代谢调节。

9、微生物的分解代谢阻遏现象：在初级代谢和次级代谢中都存在，其含义是指代谢过程中酶的合成往往受高浓度的易被迅速分解利用的碳源或氮源抑制。

10、结合：放线菌杂交过程中的染色体交换有两种情况，一种是供体部分染色体与受体全部染色体结合，一种是供体部分染色体与受体部分染色体结合，形成重组体组。

11、原始亲本：原始亲本是微生物杂交育种中具有不同遗传背景的优质出发菌株，主要根据杂交的目的来选择。

12、直接亲本：在杂交育种中具有遗传标记和亲和能力而直接用于杂交配对的菌株，成为直接亲本。

13、广义的基因工程育种：包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。

14、狭义的基因工程育种：仅指那些以微生物本身为出发菌株，利用基因工程方法进行改造而获得的工程菌，或者是将微生物甲的某种基因导入到微生物乙中，使后者具有前者的某些性状或表达前者的基因产物而获得新菌种。

15、载体是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具。

16、原生质体再生育种：原生质体再生育种是微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中奋力筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正突变菌株。原生质体再生育种不用任何诱变剂处理，而能产生比常规诱变还高的正变率。

17、原生质体诱变育种：它是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。

18、原生质体融合育种：是指双亲本原生质体在促融剂作用下相互接触，融合成一个细胞，然后核融合，最终强制性地将双亲基因组融合，DNA交换、重组并产生新性状。





论述

1、工业微生物育种技术的发展经历了几个阶段

（1）自然选育：对工业微生物育种有很大的影响。例如

①、在酒精发酵中，推广了自然选育的纯系良种，扭转了酒精生产

中的不稳定现象。

②、由于自然突变频率低，单纯依赖自然界存在的微生物群体来进行的自然选育无疑有很大的局限性，进而推进了人工诱变育种的发展。

（2）诱变育种

①、发酵工业中的各种优良高产菌株绝大部分都是诱变育种方法获得的菌株。

②、但是，菌株长期使用诱变剂处理后，会产生诱变剂疲劳效应，所以出现了杂交育种。

（3）杂交育种

①、杂交育种也应当建立在诱变育种的基础上。

②、杂交育种的主要目的在于把不同菌株的优良经济性状集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的上述缺陷，同时杂交还是增加产品新品种的手段之一。

（4）代谢控制育种

①、是以20世纪50年代谷氨酸发酵取得成功为起点的

②、代谢控制育种的活力在于以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量生成和积累。

（5）基因工程育种

2、利用平皿中生化反应进行分离

（1）透明圈法

①、原理：在平板培养基中，加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。

②、应用：在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶等。

（2）变色圈法

①、原理：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能快速鉴别出来。

②、如筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。

③、在分离产生脂肪酶的菌株时，如以土温为底物，尼罗兰作为指示剂，根据变色圈的大小来判断脂肪酶的活性高低。也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明B为指示剂，以荧光圈来测定。

（3）生长圈法

①、适用范围：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。

②、原理：工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检测菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。

（4）抑菌圈法

①、应用：常用于抗生素产生菌的分离筛选。

②、采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。











3、诱变后的突变株常用的筛选方法有两大类：

（1）、随机筛选

随机筛选也称摇瓶筛选，主要是随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛

选。

具体做法是：将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一支斜面，然后一个斜面的菌体接入一只三角瓶，放置在摇瓶机上振荡培养，根据测定产物活性的高低，决定取舍。

（2）、平板菌落预筛

在随机的突变群体中，有益突变率极低。因此，在诱变育种中，育种工作者常常能够根据代谢产物的特异性，在琼脂平板上设计须都巧妙的筛选方法和活性粗测方法。

①根据形态筛选突变株

部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性。

②根据平板菌落生化反应筛选变株

通过琼脂平板上的透明圈、呈色圈、抑制圈及浑浊圈等生化反应来筛选水解酶、有机酸及抗生素等有益代谢产物。

③采用冷敏感菌筛选抗生素变株

冷敏菌可根据菌种选育目的进行选择，可选用那些对抗生素产生耐药性的微生物，也可以筛选至今尚无有效抗生素对付的微生物。

④浓度梯度法

一个菌株合成抗生素的水平与其耐自身产物能力大小有关。野生菌或低产菌总是比高产菌株耐自身抗生素能力差。也就是说，菌株产生抗生素水平受到它自身所产抗生素数量的制约，耐受性越高，抗生素产生能力也就越强。

⑤琼脂块大通量筛选变株

是将生长突变株的平板用打孔器打下琼脂块，转移到生物鉴定平板上进行测定，此方法效率高、筛选量大。

⑥应用复印技术快速筛选变株

应用复印技术从平板上可直接筛选产脂野生株和具有髙脂含量的突变株，是产脂微生物的简便检测方法。



简答

1、物理诱变剂的生物学效应

（1）、物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一些列复杂的连锁反应过程。

（2）、其作用通常分为物理，物理-化学，化学和生物学等几个阶段。

（3）、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种类不同而有所差异，电离辐射主要引起DNA上的基因突变和染色体的畸变；非离辐射主要导致形成嘧啶二聚体。

2、烷化剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（简称亚硝基胍）的性质

（1）、符号NTG或NG或MNNG

（2）、NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合诱变营养缺陷型突变株；还可使多基因并发突变。

（3）、处理完毕后，马上把接触过的NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。

（4）、NTG的诱变方法：①孢子悬液的制备②NTG母液制备③混合④终止反应，除去药液，得孢子用无菌水稀释后涂皿。

3、稀释涂布和划线分离法

（1）、稀释涂布分离法：

①土

壤样品以十倍级差稀释，涂平板，待长出单个菌落后，挑取需要的菌落一道斜面培养基上培养。②土壤样品的稀释程度，要看样品中的菌含量多少来进行稀释。

（2）、划线分离法

①用接种环取部分样品，在培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养备用。

4、PHA的合成机制和发酵特点

微生物发酵合成可降解塑料是指微生物把某些有机物作为营养来源，由微生物发酵合成PHA时，在碳源过量和某些营养物质缺乏条件下，许多微生物的正常代谢途径被破坏，在其细胞内合成某些结构的PHA，成为碳源和能量的储存物质。

5、诱变剂的处理方式

（1）、两个以上因子同时处理

（2）、不同诱变剂交替处理

（3）、同一种诱变剂连续重复使用

（4）、紫外线光复活交替处理

（5）、诱变剂处理时间与诱变效应的关系

6、影响突变率的因素

（1）、菌种遗传特性不同

（2）、菌体细胞壁结构

（3）、环境条件的影响

7、在筛选营养缺陷型菌种中，与之有关的培养基有三类

①基本培养基（MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长所需要的培养基，称基本培养基

②完全培养基（CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称完全培养基

③补充培养基（SM，也称选择性培养基）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基，称补充培养基。











8、营养缺陷型菌株的分离和筛选

（1）营养缺陷型的诱发

适合诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍、紫外线、亚硝酸等。

（2）淘汰野生型菌株

①、抗生素法：常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。

②、菌丝过滤法：真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。

（3）营养缺陷型的检出

野生型细胞和营养缺陷型细胞数量比例发生变化，但还是混合体，需要设法把缺陷性从群体中分离出来：

①、点植对照法；②、影印法；③、夹层法

9、抗噬菌体菌株的选育

在微生物发酵工业中，除设备和环境中存在大量噬菌体外，生产菌种也常遭受污染而严重退化。抗噬菌体菌株的选育程度具体方法如下：

（1）、专一性噬菌体获得和纯化

（2）、高效价噬菌体原液制备

（3）、菌株诱发突变和分离

（4）、液体摇瓶振荡培养

（5）、进一步考察抗性菌株对周围环境中存在的各种噬菌体的抗性

10、初级代谢与次级代谢的关系

根据微生物在代谢过程中产生的代谢产物在生活机体内的

作用不同，又可将代谢分成初级代谢与次级代谢两种类型。通常把微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质称为初级代谢产物。而产生这些物质的代谢体系称为初级代谢。次级代谢产物是对产生它们的生物体本省不需要的一种产物，也就是说该产物的生成对维持生命、发育和增殖没有特别关系的蛋白质、酶以及这些酶催化生成的物质称次级代谢产物。从菌体生化代谢角度来说，次级代谢产物其基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的。次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的。

11、解除磷酸盐调节突变株的选育



12、杂交的特点

（1）、通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗产物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质的基础，扩大变异范围，使两株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。

（2）、通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅客服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应。

（3）、通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。

13、微生物杂交育种基本程序

选择原始亲本---诱变筛选直接亲本---直接亲本之间亲和力鉴定---杂交---分离到基本培养基或选择培养基培养---筛选重组体---重组体分析鉴定。

14、微生物杂交育种的遗传标记

（1）、营养缺陷型标记

（2）、抗性标记

（3）、温度敏感性标记

（4）、其他性状标记（菌落形态，可溶色素的含量等）

15、细菌原生质体融合育种得主要的核心技术在以下三个方面

（1）、提高细菌原生质体制备率和再生率的方法。

①预处理：为了便于溶菌酶的讲解，可以加入物质进行预处理后在破壁，如化学物质EDTA、巯基乙醇，细胞壁合成抑制因子青霉素、甘氨酸。

②溶菌酶：对热和酸碱性有较大的适用范围，对溶解酶不敏感的可以加大酶的浓度和更换水解酶。

③细菌生理状态：对数生长期，代谢最旺盛，对溶解酶最敏感。

（2）、建立最佳融合体系：

①融合剂的浓度：PEG4000～6000，浓度40%～50%。

②融合剂的处理温度：一般低温融合重组率较高。

③融合剂处理时间：处理时间一般少于30min，时间长会使融合率降低。

（3）、重组子分离模型：建立一个高效、简便的筛选模型。

16、融合重组体分析与鉴定

①细胞和菌落形态：菌落的形态、大小和颜色等。

②DNA含量：采用二苯胺法测定亲本和融合体的DNA含量

③产物：产物的产量的比较

④孢子大小和红外光谱

17、基因工程的步骤

①目的基因的获得

②载体的选择与准备

③目的基因与载体连接成重组DNA

④重组体的筛选
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