细菌的人工培养

任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；
常规高压蒸汽灭菌： 1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟
培养基制备的一般程序
调配
培养基灭菌
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟
溶化
矫正pH
★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟 过滤澄清 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 分装 灭菌 检定 ★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
保存
1、选用和设计培养基的原则和方法
目的明确 营养协调 理化条件适宜
经济节约
1）目的明确
根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。
培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为： S 10g MgSO4.7H2O 0.5g NH4)2SO4 0.4g CaCl2 0.25g H2O 1000ml FeSO4 0.01g H2PO4 4g
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生物的 基础理论和应用方面的研究
含有一般微生物生长繁殖所 需的基本营养物质的培养基 按 用 途 不 同 划 分 基础培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的 一类营养丰富的培养基。特殊营养物质包括血 液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等 在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质， 用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体 抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物 中分离出来的培养基 的生长
4）经济节约
以粗代精
以氮代朊
以野代家
以废代好 以简代繁
以纤代糖
以烃代粮 以国代进
2、培养基的类型及应用
培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用 途可将培养分成多种类型。 含用化学成分还不清楚或化 学成分不恒定的天然有机物 天然培养基 按 成 牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽 分 汁培养基 不 同 化学成分完全了解的物质配 划 合成培养基 分 制而成的培养基
b. 水活度
在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量， 一般用在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸汽压力与同样条 件下纯水蒸汽压力之比表示，即： α w=Pw/Pow 式中Pw代表溶液蒸汽压力, POw代表纯水蒸汽压力。 纯水α w为1.00,溶液中溶质越多, α w越小。
微生物一般在α w为0.60～0.99的条件下生长, α w过低时, 微生物生长的迟缓期延长,比生长速率和总生长量减少。 微生物不同，其生长的最适α w不同。
二、细菌的分离培养和接种技术
(一)接种工具

接种针和接种环：由三部分组组成，即环
Hale Waihona Puke （针）、金属柄和绝缘柄。接种前后都要过
火灭菌。接种针用于穿刺接种细菌，接种环 用于固体、液体培养基的细菌接种。

L型玻璃棒：用于琼脂平板涂布接种细菌。
（二）接种环境

操作需在接种罩、超净工作 台或无菌室内进行。
（三）细菌接种的基本程序
培养化能异养的大肠杆菌一种培养基是由下列化学成分组成： 葡萄糖 5g NH4H2PO4 1g NaCl 5g MgSO4.7H2O 0.2g 1g H2O 1000ml
K2HPO4
常见的培养四大类微生物的培养基
细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g H2O 1000ml
霉菌（查氏合成培养基） NaNO3 3g K2HPO4 0.01g 蔗糖 30g
1g H2O
KCl 1000ml
0.5g
MgSO4.7H2O
0.5gFeSO4
2）营养协调
培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满 足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用。
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本
沾取标本
接种
灭菌接种环
杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
细菌接种的基本程序
灭菌接种环
取菌种试管和待 接种的斜面试管
沾取标本
接种
接种后灭菌接种环
（四）接种方法
1.平板划线接种法：

目的：使混合的细菌呈单个分
散生长，形成单个菌落，以便 获得纯菌。

放线菌（高氏1号） 淀粉 20g K2HPO4 0.5g NaCl FeSO4 0.01g H2O 1000ml
0.5g
MgSO4.7H2O
0.5g
KNO3
1g
酵母菌(麦芽汁培养基) 干麦芽粉加四倍水，在50℃--60℃保温糖化3-4小时，用碘液试验检查至糖化完全 为止，调整糖液浓度为10。巴林，煮沸后，沙布过滤，调PH为6.0。
c. 氧化还原电位
氧化还原电位又称氧化还原电势（redox potential），是度量 某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势 的一种指标，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。
不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同
好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长,以+0.3～+0.4伏为宜； 厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长； 兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸, +0.1伏以下时进行发酵。
营养培养基
选择培养基 鉴别培养基
用于鉴别不同类型微生物的培养基 微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊 化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特 征变化
厌氧培养基
高压蒸汽灭菌法
• • • • 压力：1.05kg/cm2 温度：121.3℃ 时间：15～30min 效果
–杀死一切微生物， 包括芽胞
3）理化条件适宜
pH 水活度 氧化还原电位
a. pH 培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型 微生物的生长繁殖或产生代谢产物。
通常培养条件：
细菌与放线菌：pH7~7.5 酵母菌和霉菌：pH4.5~6范围内生长 为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入 pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。
方法：

分区划线法：适用于含菌量 较多的标本。 连续划线法：适用于含菌量 较少的标本。

分区划线法
第一区划线
灭菌接种环
第二区划线
灭菌接种环
第三区划线
灭菌接种环
连续划线法
Autoclaving
• 耐高热、不怕潮湿 的物品
高压蒸汽灭菌法的注意事项
包裹适中，垂直放置，留有空隙，容器开盖，勿
装过满，便于流通。 布类物品置于上层，瓶装液体不宜过满（不超过 3/4) 排尽冷气，以免影响蒸汽饱和
灭菌时间达标计算，减压至零，方可取物
灭菌效果，每次检测 注意安全，专人监测 灭菌物品，有效时间两周
培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产 物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。
碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，有时也指培养基中还原糖 与粗蛋白之比。
例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培 养基碳氮比为4/1时，菌体量繁殖，谷氨酸积累少； 当培养基碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷 氨酸产量则大量增加。
高氏1号培养基、查氏培养 基
在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成 为固体状态，琼脂含量一般为1.8%-2.5%
按 物 理 状 态 不 同 划 分
固体培养基 半固体培养基
固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、 活菌计数及菌种保藏
琼脂含量一般为0.2%-0.8%
观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌 体效价滴定
结晶紫 1min 卢戈碘 1min 95%乙 醇30s 稀释复 红 30s
革 兰 染 色
革兰染色结果
油镜下模式图 ×1000
二、细菌的人工培养
根据细菌的生理需要和繁殖规律，用人 工方法为细菌提供营养物质和适宜的环 境条件，使细菌在短时间内大量繁殖， 称为细菌的人工培养。
（一）培养基
培养基是人工配制的，适合细菌生长繁殖或产生代谢 产物的营养基质。 培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础