细菌的人工培养
细菌的人工培养
人工培养细菌的意义
在医学中的应用：诊断；细菌鉴定；生物制品。 在工农业生产中的应用 ： 在基因工程中的应用
Stationary Phase
Logarithmic growth phase
Death Phase
Lag Phase
细菌在培养基中生长现象
固体培养基：菌落colony
平板接种
巧
克
杂菌污染
力
平
板
鉴别及选择培养基
EMB琼脂平板上大肠菌 SS琼脂平板上大肠菌为
菌落具有金属光泽
粉红菌落
Control organisms : Escherichia coli : Pink colonies (lactose fermentation) Proteus mirabilis : Colorless colonies ,no spreading Enterococcus sp. : No growth
Control organisms : Escherichia coli : A/A (G) Shigella flexneri : K/A Proteus vugaris : K/A, H2S Pseudomonas aeruginosa : K/N
Incubate : Aerobic 35° C, 24 hrs Shelf life : 8 weeks Price (Baht) : 5 (return tube)
Lowenstein-Jensen Medium
微生物试验-细菌的人工培养及形态学检查
实验一 细菌的人工培养
一、细菌在自然界的分布
1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记 方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，
暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱 培养24小时，观察结果。
2.人体表面细菌的检查---手 指（每组1个平皿）
方法：取一普通平皿培养 基，一部分标记“前”， 另一部分标记“后”，然 后将手指在标记“前”的 部分沾一下，洗手后在标 记“后”的部分沾一下。 放入37℃温箱培养24h后 观察细菌的生长情况。
呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌 中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表 皮葡萄球菌。
二、 理化因素对细菌的影响
1.物理因素对细菌的影响---紫外线
原理：紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相邻 的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰 DNA 的复制与转录导致细菌变异或死亡。
3.人体内部细菌的检查--咽喉部
方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平 皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约 10cm， 对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放 入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。
二、外界因素对细菌的影响：
1.物理因素对细菌的影响 ：
紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌， 一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作 用。
满足a充足的营无菌
（三）分类：1、按物理性状
分类：
+0.3~0.5%琼脂
+1.5~2.5%琼脂
半固体培养基 液体培养基
固体培养基
观察细菌动力 大量繁殖细菌 细菌的分离和纯化
短期保存菌种
固体平板培养基
液体培养基
固体斜面培养基 半固体培养基
实验细菌的人工培养
常用消毒器械的介绍
一、人工培养基的制备和种类
1.制备原则 2.制备程序 3.常用培养基的分类
1.制备原则
（1）适当的营养成分； （2）合适的酸碱度； （3）配制后经灭菌使之无菌，方可应用。
2.制备程序
配料→熔化→测定及矫正PH→滤过 →分装→灭菌→备用
3.常用培养基的分类
（一）按物理性状分：
生化反应——Indol实验
靛基质试验：分别接种（大3肠）埃希半菌和固伤体寒沙培门菌养于基蛋白：胨水沿培穿养基刺（含线色生氨酸长）内，，穿置37刺度2线4小清时培晰养后，，周然后沿管壁徐徐加入靛基
质试剂（对二甲基醛）数滴，静置片刻，在两液界面出现红色环者为靛基质试验阳性（大肠埃希菌），无红色环者为阴性（伤寒沙门
菌 （）2）。固体培养基：菌落和菌苔。围培养基仍为透明，动力阴性；穿刺线向周围扩 观穿察刺菌 线落向的周大围小扩、散形生态长、，透穿明刺度线、模散颜糊色，生、整长表个面培，和养边基穿缘变刺情成况混线及浊菌，模落动糊周力围阳，有性无。整溶个血环培等。养基变成混浊，动 力阳性。 （2）细菌对氨基酸分解产物观察
2.细菌的代谢产物观察
（1）细菌对糖分解产物观察
方法：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于葡萄糖、乳糖发酵 培养基中，置37度24小时培养后观察结果。
结果：大肠埃希菌分解葡萄糖、乳糖，产酸产气；
伤寒沙门菌分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖。
糖 发 酵 试 验
2.细菌的代谢产物观察
（2）固体•培养基：菌落（和菌2苔）。 细菌对氨基酸分解产物观察
液体培养基 固体培养基: 1.5～2.5% 琼脂 半固体培养基: 0.3～0.5%琼脂
（二）按用途不同可分：
基础培养基； 营养培养基； 选择培养基； 鉴别培养基； 厌氧培养基。
细菌的人工培养方法
细菌的人工培养方法[适用对象]生物工程专业[实验学时] 4学时一、实验目的了解常用的液体、固体和半固体培养基的成分、制备方法和用途。
初步掌握各种培养基接种技术；观察细菌在培养基中的生长现象；认识菌落、菌苔。
二、实验原理培养基是用人工方法将微生物生长繁殖所需的多种营养物质调配在一起，形成的一种营养物质的混合物，用以分离、传代和培养细菌。
按培养基的用途分为基础（普通）培养基、营养培养基、鉴别培养基，选择培养基、厌氧培养基等。
按培养基的物理形状又分为液体、固体和半固体三种。
三、仪器设备三角烧瓶、天平、试管、平皿、高压消毒灭菌器。
四、相关知识点培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
在自然界，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基的种类很多。
但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。
了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。
五、实验步骤（一）常用培养基的制备1、普通液体培养基(1)将新鲜的精牛肉除去脂肪和筋膜制成肉馅，取500克牛肉馅加l000ml蒸馏水，置4℃冰箱浸泡过夜，使牛肉中的水溶性营养物质充分浸出。
(2)次日将浸泡过夜的牛肉馅加热煮沸30分钟，放凉，使残余的脂肪凝固，然后用纱布和滤纸过滤，最后将滤液补足为原量，此种液体为牛肉浸汁。
(3)取1 000ml牛肉浸汁加蛋白胨10克，氯化钠5克加热溶解，冷至50℃左右时用氢氧化钠调整pH至7．6，再煮沸10分钟(因牛肉浸汁中部分碳水化合物，经加热破坏产酸，影响pH；产生多磷酸盐，培养基不澄清)待冷却后，再调整pH至7．6，然后以滤纸过滤，滤液必须澄清，此种液体称为肉汤培养基。
(4)将肉汤培养基分装于试管或三角烧瓶中，塞好试管和瓶塞，包装好后，用15磅(121℃)蒸气15～30分钟灭菌。
细菌的人工培养
大肠杆菌在不同培 养基上形成的菌落
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
细菌在固体培养基中的生长情况
菌落（R型）
固体培养基中 菌落（S型）
菌苔
细菌在固体培养基中的生长情况
光滑型菌落
粗糙型菌落
粘液型菌落
液体 培养基
斜面 培养基
纯培养 (pure culture)
菌落(colony)
三、人工培养细菌的意义
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
（一）病料的采集、保存及运送
采集原则
无菌采病料 适时采病料 病料中病原含量多 采集适量病料：至少 检测量的4倍 低温保存 尽快送检 做好记录
（二）细菌的形态检查
1.病料处理
将病料涂成薄而均匀的涂片→室温下自然干
燥→若为细菌培养物涂片火焰固定 常用的染色方法有：革兰染色法、美蓝染色 法、瑞氏染色法和姬姆萨染色法
OH二乙酰 + 含胍基 化合物
（—）
（ +）
红色（+）
3、甲基红(methyl
red)试验：
葡萄糖
丙酮酸 （pH值>5.4） 甲酸、乙酸（红色）
（pH<4.5）
（—）
（+）
（五）动物接种试验
意义
为了证实所分离 菌是否有致病性 本动物
脑内接种
试验动物
静脉注射 腹腔注射
2. 毒素
来源：细菌生长繁殖中产生和释放的毒性 成分
作用：可直接或间接损伤宿主细胞、组织
和器官，干扰其生理功能
种类：外毒素和内毒素
接种途径
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
一、致病性与毒力
人工培养细菌
细菌的人工培养人工制备营养充足的培养基并提供适宜的温度、气体、pH等培养条件，即能使细菌在体外环境迅速生长繁殖。
细菌培养对临床上病原菌的分离鉴定、制备抗生素、制备疫苗等生物制品都是必不可少的。
一、培养基的制备原则：1、必须有充足的营养。
2、合适的酸碱度。
3、绝对无菌。
二、培养基的制备培养基是用人工方法将多种营养物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养料。
常用的培养基有基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基等。
按照培养基的物理性状可分为液体，固体和半固体三类。
以下介绍常用基础培养基的制备。
（一）肉汤培养基：制法：称取营养肉汤粉1.8g（含牛肉膏0.3克g，蛋白胨1g、氯化钠0.5g）加入100ml蒸馏水中，用玻棒搅拌加热溶解。
按需要分装于三角瓶或试管，瓶口或管口塞棉塞，包装后置高压蒸汽灭菌器内，在0.11Mpa（1.05公斤/厘米2）压力下，温度达1210C，维持15～20分钟。
冷却后贴好标签，40C冰箱贮存备用。
制成后的肉汤呈浅黄色，清晰透明，pH 7.1+0.2肉汤培养基常用于增菌培养。
（二）肉汤琼脂固体培养基：在上述肉汤培养基中加入2～3%琼脂即成。
经高压灭菌后，趁热将试管斜置、冷凝，即成普通琼脂斜面培养基；或趁热取出后，稍冷，以无菌操作倾入灭菌的空培养皿，冷凝后即为普通琼脂平板。
制作琼脂平板时，每一空皿（9厘米直径）需培养基15～20ml。
普通琼脂平板用于分离培养繁殖细菌；普通琼脂斜面用于纯培养和保存菌种。
（琼脂是从石花菜等海藻类中提取的多糖物质，当温度达到98℃以上可溶化，45℃以下则凝固。
琼脂对细菌一般无营养作用，用做斜面、平板、高层等不同类型固体培养基的凝固剂。
琼脂通常呈酸性，加入液体培养基中可使酸碱度下降pH 0.2左右。
）（三）肉汤琼脂半固体培养基：在上述肉汤培养基中加入0.3～0.5％琼脂，加热溶化后，分装于小试管（10×100mm），每管约3ml，高压灭菌后直立冷凝即成。
5.第二章 细菌的生物学特性,第五节细菌的人工培养
一、培养细菌的方法
分离培养
将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散作用 ，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。
菌落
一般经过18~24小时培养后,单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的 细菌集团，称为菌落。
二、培养基
固体培养基：菌落，菌苔
二、培养基
液体培养基
半固体培养基
三、细菌在培养基中的生长现象
（一）在液体培养基中生长情况 混浊：大多数细菌 沉淀：链状生长的细菌 菌膜：专性需氧菌，如结核杆菌、枯草杆菌
三、细菌在培养基中的生长现象
（三）在半固体培养基中生长情况
通过分离培养，细菌可在固体培养 基上形成菌落。不同细菌大小、形 状、颜色、气味有助于鉴定细菌。 细菌的菌落一般分为：光滑性菌落、 粗糙性菌落和黏液性菌落。
纯培养
挑取一个菌落，移种到另一个培养基中，可生长出来的大量的纯种 细菌，称为纯培养。多用于某些菌种的扩増。
二、培养基
培养基：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混 合营养物础培养基 增菌培养基 选择培养基 鉴别培养基 厌氧培养基
按其物理状态
液体培养基 固体培养基 半固体培养基
在工农业生产中的应用 在基因工程中的应用
本章小结
培养细菌的方法：分离培养，纯培养 培养基要求：营养物质、pH、渗透压、温度、气体 培养基的分类：营养组成和用途、物理状态 细菌培养用途：医学、工农业、基因工程
细菌的生物学特性
学习 目标
掌握 培养基的要求，菌落的概念，培养基的分类 熟悉 细菌在培养基中的生长情况 了解 人工培养细菌的用途
第五节
实验二细菌的接种、培养及代谢产物
实验二细菌的接种、培养及代谢产物（B a c t e r i a l I n o c u l e t i o n a n d A r t i f i c a l C u l t u r e a n dM e t a b o i c p r o d u c t s）一、细菌的人工培养（A r t i f i c a l C u l t u r e o f B a c t e r i a）在适当条件下，绝大多数细菌可用人工方法培养，使其繁殖，通过人工培养，获得纯种细菌，是进一步观察研究各种细菌具有不同特性的基础。
(一)常用培养基的制备1、肉汤培养基：是常用的液体培养基，也是制备某些其他培养基的基础。
材料：（制备100m l肉汤培养基的用量）(1)培养基的成分：牛肉50g蛋白脂1g氯化钠0.5g磷酸氢二钾(K2H P04·12H20)0.1g蒸馏水100m1(2)玻皿、试剂、比色管、比色架、吸管、1N与1／20N 的N a O H、三角烧瓶、漏斗、中试管、酚红指示剂、滤纸、卷筒、天平、蒸馏水。
方法：（1）将已去筋膜脂肪并经绞碎鲜牛肉50g，加蒸馏水100m l，放入冰箱中过夜。
（2）加热45—50℃一小时，并煮沸半小时，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用蒸馏水补足其量为100m1。
（3）于滤液中加氯化钠0.5g，蛋白脂1g、磷酸氢二钾0.1g，加热使之完全溶化。
（4）测定酸碱度并调整至P H7.6，必要时用滤纸过滤。
（5）按需要分装于试管或烧瓶内，加棉花塞并包装后，置高压蒸汽灭菌器内经15磅／寸220—30分钟灭菌。
（6）灭菌后置37℃温箱，孵育24h，无杂菌生长，即可应用。
或放冰箱备用。
2、普通琼脂培养基它是最常用的固体培养基。
材料：肉汤、琼脂方法：(1)在肉汤中加入2％琼脂，熔化后调整P H7.6，必要时用棉花纱布过滤。
(2)于琼脂凝固前，分装于试管或小烧瓶内，然后加棉塞并包装。
(3)放入高压蒸汽灭菌器内，经15磅/寸220分钟灭菌。
细菌的人工培养
无菌 asepsis： 不存在活菌的意思。防止微生物进入人体 或其它物品的操作技术，称为无菌操作。
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二、物理消毒灭菌法
（一）热力灭菌法
1、干热灭菌法: 焚烧: 废弃物品、动物尸体等。 烧灼：接种环、试管口。 干烤：玻璃器皿、瓷器、玻制注射器等。 红外线：医疗器械等。
2、细菌在培养基中的生长现象
液体培养基：混浊生长、菌膜、沉淀生长 半固体培养基：沿穿刺线生长或扩散生长 固体培养基：菌落
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液体培养基：混浊生长、菌膜、沉淀生长
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半固体培养基：沿穿刺线生长或扩散生长
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固体培养基：菌落
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液体 培养基
斜面 培养基
纯培养 (pure culture)
菌落(colony) 24
一、消毒灭菌的常用术语
消毒 disinfection： 杀死物体上病原微生物的方法，并不一 定 能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物 。
灭菌 sterilization：
杀灭物体上所有微生物的方法，包括芽
胞 在内的全部病原微生物和非病原微生
物。
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清洁 cleaning：指去除尘埃和一切污秽以减少微 生物数量的过程。
干扰细菌的酶系统和代谢 如氧化剂、重金 属盐类（低浓度）
损伤菌细胞膜 如酚类（低浓度）、表面活 性剂、脂溶剂等
42
四、消毒灭菌的应用
选用的消毒剂
病人排泄物、 分泌物
20％漂白粉，5％石炭酸，2％来苏，作用2h
皮肤
2.5％碘酊，70％乙醇
粘膜
1％硝酸银，0.1％新洁尔灭
人工培养细菌
细菌的人工培养人工制备营养充足的培养基并提供适宜的温度、气体、pH等培养条件，即能使细菌在体外环境迅速生长繁殖。
细菌培养对临床上病原菌的分离鉴定、制备抗生素、制备疫苗等生物制品都是必不可少的。
一、培养基的制备原则：1、必须有充足的营养。
2、合适的酸碱度。
3、绝对无菌。
二、培养基的制备培养基是用人工方法将多种营养物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养料。
常用的培养基有基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基等。
按照培养基的物理性状可分为液体，固体和半固体三类。
以下介绍常用基础培养基的制备。
（一）肉汤培养基：制法：称取营养肉汤粉1.8g（含牛肉膏0.3克g，蛋白胨1g、氯化钠0.5g）加入100ml蒸馏水中，用玻棒搅拌加热溶解。
按需要分装于三角瓶或试管，瓶口或管口塞棉塞，包装后置高压蒸汽灭菌器内，在0.11Mpa（1.05公斤/厘米2）压力下，温度达1210C，维持15～20分钟。
冷却后贴好标签，40C冰箱贮存备用。
制成后的肉汤呈浅黄色，清晰透明，pH 7.1+0.2肉汤培养基常用于增菌培养。
（二）肉汤琼脂固体培养基：在上述肉汤培养基中加入2～3%琼脂即成。
经高压灭菌后，趁热将试管斜置、冷凝，即成普通琼脂斜面培养基；或趁热取出后，稍冷，以无菌操作倾入灭菌的空培养皿，冷凝后即为普通琼脂平板。
制作琼脂平板时，每一空皿（9厘米直径）需培养基15～20ml。
普通琼脂平板用于分离培养繁殖细菌；普通琼脂斜面用于纯培养和保存菌种。
（琼脂是从石花菜等海藻类中提取的多糖物质，当温度达到98℃以上可溶化，45℃以下则凝固。
琼脂对细菌一般无营养作用，用做斜面、平板、高层等不同类型固体培养基的凝固剂。
琼脂通常呈酸性，加入液体培养基中可使酸碱度下降pH 0.2左右。
）（三）肉汤琼脂半固体培养基：在上述肉汤培养基中加入0.3～0.5％琼脂，加热溶化后，分装于小试管（10×100mm），每管约3ml，高压灭菌后直立冷凝即成。
《医学微生物学》细菌的人工培养实验
《医学微生物学》细菌的人工培养实验[目的]1．掌握平板划线法、斜面、液体和半固体培养基等各种接种方法。
2．掌握接种细菌用具、接种细菌的环境要求和无菌操作要领。
3．熟悉常用培养基的原理、种类及其用途。
4．熟悉细菌和二氧化碳培养方法。
5．熟悉常用的厌氧菌培养技术。
6．了解培养基制备的基本过程。
[内容]（一）、培养基制备技术[材料]1．试剂：牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、抗凝绵羊血、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇、柠檬酸钠、硫酸镁、磷酸二氢铵、硝酸钾、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、硫酸。
亚铁、尿素、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、酚红、lmol ／L NaOH、lmol／L HCl。
2．器材：500ml锥形瓶、500ml量筒、10ml、5ml和lml吸管、精密pH试纸、华氏试管、硅胶塞、天平、高压蒸气器、血清凝固器、脱脂棉、滤纸、漏斗、无菌平皿。
[方法]1．培养基制备的基本过程包括调配成分、溶解、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、质量检查和保存。
（1）调配成分：按培养基组成准确称取各成份用量，放入锥形瓶或大容量烧瓶中，加一定量蒸馏水，使其充分混合。
应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH后加入。
（2）溶解：将调配好的混合物在沸水浴或流动蒸气灭菌器中，使其完全溶解。
不可将培养基装在铜铁容器中加热，因培养基中含铜量超过0.3mg／L时，细菌不易生长；含铁量超过0.14mg／L时可抑制细菌毒素的产生。
（3）矫正pH：一般将培养基的pH调至7.2～7.6左右。
经高压灭菌后其pH可发生0.1～0.2变动。
若用NaOH矫正，高压灭菌后pH下降0.1～0.2；若用Na2CO3矫正，高压灭菌后pH升高0.1～0.2。
（4）滤过澄清：自配的培养基通常有一些混浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。
液体或半固体培养基常用滤纸过滤；固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。
（5）分装：①基础培养基：一般分装于锥形瓶灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；②琼脂斜面：通常在熔化后分装于试管，量约为试管高度的1/4～1/3，加塞后灭菌，趁热摆成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3，且保持试管下端1cm柱高；③半固体培养基：分装量为试管量的1/4-1/3，加塞灭菌后趁热直立凝固④琼脂高层培养基：分装量为管长的2/3(接种厌氧菌用)，灭菌后趁热直立凝固；⑤琼脂平板无菌分注：先将灭菌琼脂熔化后冷却至50℃左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内(内径90mm的平皿约13～15min)，水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置4℃保存备用。
第三节 细菌的人工培养
第一篇微生物的基本知识第一章细菌第三节细菌的人工培养用人工的方法，提供细菌生长繁殖所需要的各种条件，可进行细菌的人工培养，从而进行细菌的鉴定和进一步的利用。
细菌的人工培养技术是微生物学研究和应用的重要手段。
一、培养基的概念把细菌生长繁殖所需要的各种营养物质合理地配合在一起，制成的营养基质称为培养基。
培养基的主要用途是促进细菌的生长繁殖，可用于细菌的分离、细菌的纯化、细菌的鉴定、细菌的保存和细菌制品的制造等。
二、培养基的类型由于各种细菌的营养需求不同，所以培养基的种类繁多，根据培养基的物理状态、用途等可将培养基分为多种类型。
（一）根据培养基的物理状态分类1．液体培养基将细菌生长繁殖所需的各种营养物质直接溶解于水，不加凝固剂制成的培养基为液体状态，即为液体培养基。
液体培养基中营养物质以溶质状态存在其中，利于细菌充分的接触和利用，从而使细菌更好地生长繁殖，故常用于生产和实验室中细菌的扩增培养。
实际操作中，在使用液体培养基培养细菌时进行振荡或搅拌，可增加培养基中的通气量，并使营养物质更加均匀，可大大提高培养效果。
2．固体培养基在液体培养基中加入2%～3%的琼脂，使培养基凝固成固体状态。
固体培养基可根据需要制成平板培养基、斜面培养基和高层培养基等。
平板培养基常用于细菌的分离、菌落特征观察、药敏试验以及活菌计数等；斜面培养基常用于菌种保存；高层培养基多用于细菌的某些生化试验。
3．半固体培养基在液体培养基中加入少量（通常为0.3%～0.5%）的琼脂，凝固后培养基呈半固体状态。
多用于细菌运动性观察，即细菌的动力试验，也用于菌种的保存。
（二）根据培养基的用途分类1．基础培养基尽管不同细菌的营养需求不同，但大多数细菌所需的基本营养物质是相同的。
基础培养基含有细菌生长繁殖所需要的最基本的营养成分，可供大多数细菌人工培养用。
常用的是肉汤培养基、普通琼脂培养基及蛋白胨水等。
2．营养培养基在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水、酵母浸膏及生长因子等，用于培养营养要求较高的细菌，常用的营养培养基有鲜血琼脂培养基、血清琼脂培养基等。
医学微生物学实验PPT实验三细菌的人工培养
汇报人：可编辑 2024-01-11
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 实验总结与思考
01 实验目的
掌握细菌的人工培养技术
了解细菌生长所需的 营养条件和环境因素 。
学会接种、培养和观 察细菌的方法。
掌握培养基的制备和 灭菌技术。
落。
稀释分离法
通过将细菌稀释到一定浓度后，均 匀涂布在培养基表面，使细菌在培 养基上独立生长成单菌落。
选择性分离法
利用选择性培养基的特殊成分或抑 制剂，抑制非目标菌的生长，使目 标菌成为优势菌种，便于分离纯化 。
03 实验步骤
培养基的制备与灭菌
培养基制备
根据实验需求，选择适合的培养 基配方，按照比例混合各种成分 ，搅拌均匀后，调节pH值至适宜 范围。
细菌的形态、染色及生化反应结果
01
02
03
04
形态
通过显微观察，我们记录了不 同细菌的形态特征，如球菌、
杆菌、螺旋菌等。
染色
采用革兰氏染色法对细菌进行 染色，观察其染色反应并记录
。
生化反应
通过观察细菌对不同生化底物 的反应，了解其生化特性。
结论
细菌的形态、染色及生化反应 结果对于鉴别和分类细菌具有
02 实验原理
细菌的生长繁殖条件
营养物质
细菌需要从外界环境中获取营 养物质，如碳源、氮源、水、 无机盐等，以支持其生长和繁
殖。
温度
不同种类的细菌对温度的需求 不同，有些细菌在高温下生长 ，有些则喜低温。
酸碱度
细菌对环境的酸碱度也有一定 的要求，通常在pH值6-8之间 较为适宜。
气体环境
细菌的人工培养方法及意义(平板划线)
ppt课件完整
3
细菌的人工培养
一、培养基 二、细菌接种技术 三、细菌生长结果观察
ppt课件完整
4
细菌的人工培养
一、培养基
概念: 培养基是用人工方法将多种营养物质按 照各类微生物生长的需要而合成的一种混合养料。
任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大 营养要素：
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
3、什么是菌落？分离菌落的意义？
4、人工培养细菌的意义？
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如厌氧培养基。用于厌氧菌的培养。
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细菌的人工培养
培养基的制备：
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细菌的人工培养
二、细菌的接种技术
分离培养接种法——平板划线法、平行划线法 纯种细菌接种法 ——固体斜面培养基接种法
液体培养养物质制成的一 类营养丰富的培养基。如血琼脂培养基。
在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学 物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于 所需微生物的生长。用来将某种或某类微生物 从混杂的微生物群体中分离出来。如SS琼脂培养 基。
利用细菌代谢产物不同而使指示剂显色反应 不同的原理，鉴别和鉴定细菌。如麦糠凯琼 脂培养基。
任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理
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高压蒸 汽灭菌
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培养基的分类：
动物微生物2.3细菌的人工培养
项目二细菌任务三细菌的人工培养一、常用培养基：培养基：把细菌生长所需的营养物质调配在一起制成的用于培养细菌的人工养料叫做培养基。
1、常用培养基的类型：（1）按物理性状分类：液体培养基：是含有各种营养成分的水溶液。
例如：肉汤培养基。
固体培养基：在液体培养基中加入百分之二至百分之五的琼脂而制成的培养基。
例如：琼脂斜面培养基、琼脂平板培养基。
半固体培养基：在液体培养基中加入百分之零点三—百分之零点七的琼脂制成。
（2）按用途分类：基础培养基：还有大多数细菌生长共同需要的营养成分，包括牛肉浸液，1%蛋白胨和0.5%Nacl等，PH7.2—7.6，例如：肉汤培养基，普通琼脂培养基。
营养培养基：在基础培养基中添加血液，血清、葡糖糖、生长因子等，适合于营养要求较高的细菌。
例如：血液琼脂平板（链球菌、肺炎球菌在其上才能生长良好）增菌培养基：在基础培养基或营养培养基中加入某种细菌所需的特殊营养成分，配制出适合这种细菌生长而不适合其他微生物生长的培养基。
例如：亚硝酸盐增菌培养基用于沙门氏菌的增菌培养（用途）鉴别培养基：利用细菌对糖、蛋白质的能力与其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的指示剂，用于鉴别细菌。
例如：糖发酵管，硫化氢、麦康凯培养基等。
选择培养基：在培养基中加入某些化学物质，以抑制某些细菌生长而促进另一些致病菌的生长，达到选择分离的目的。
例如：SS琼脂，分离肠道菌厌氧培养基：在无氧的环境中才能生长繁殖。
例如：肝片肉汤培养基（要覆盖液体石蜡）2、培养基的基本要求：一有丰富的营养物质；二PH、水分；三均匀透明，易于观察；四经过灭菌和无菌检验。
二、细菌在培养基上的生长特征（一）菌落特征将单个微生物细胞或一小堆同种细胞接种在固体培养基的表面（有时为内部），当它占有一定的发展空间并处于适宜的培养条件时，该细胞就迅速生长繁殖。
结果会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见，并有一定形态、构造的子细胞集团，这就是菌落。
如果菌落是由一个单细胞发展而来的，则它就是一个纯种细胞群或克隆。
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任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；
常规高压蒸汽灭菌： 1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟
培养基制备的一般程序
调配
培养基灭菌
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟
溶化
矫正pH
★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟 过滤澄清 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 分装 灭菌 检定 ★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
保存
1、选用和设计培养基的原则和方法
目的明确 营养协调 理化条件适宜
经济节约
1）目的明确
根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。
培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为： S 10g MgSO4.7H2O 0.5g NH4)2SO4 0.4g CaCl2 0.25g H2O 1000ml FeSO4 0.01g H2PO4 4g
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生物的 基础理论和应用方面的研究
含有一般微生物生长繁殖所 需的基本营养物质的培养基 按 用 途 不 同 划 分 基础培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的 一类营养丰富的培养基。特殊营养物质包括血 液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等 在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质， 用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体 抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物 中分离出来的培养基 的生长
4）经济节约
以粗代精
以氮代朊
以野代家
以废代好 以简代繁
以纤代糖
以烃代粮 以国代进
2、培养基的类型及应用
培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用 途可将培养分成多种类型。 含用化学成分还不清楚或化 学成分不恒定的天然有机物 天然培养基 按 成 牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽 分 汁培养基 不 同 化学成分完全了解的物质配 划 合成培养基 分 制而成的培养基
b. 水活度
在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量， 一般用在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸汽压力与同样条 件下纯水蒸汽压力之比表示，即： α w=Pw/Pow 式中Pw代表溶液蒸汽压力, POw代表纯水蒸汽压力。 纯水α w为1.00,溶液中溶质越多, α w越小。
微生物一般在α w为0.60～0.99的条件下生长, α w过低时, 微生物生长的迟缓期延长,比生长速率和总生长量减少。 微生物不同，其生长的最适α w不同。
二、细菌的分离培养和接种技术
(一)接种工具
接种针和接种环：由三部分组组成，即环
Hale Waihona Puke （针）、金属柄和绝缘柄。接种前后都要过
火灭菌。接种针用于穿刺接种细菌，接种环 用于固体、液体培养基的细菌接种。
L型玻璃棒：用于琼脂平板涂布接种细菌。
（二）接种环境
操作需在接种罩、超净工作 台或无菌室内进行。
（三）细菌接种的基本程序
培养化能异养的大肠杆菌一种培养基是由下列化学成分组成： 葡萄糖 5g NH4H2PO4 1g NaCl 5g MgSO4.7H2O 0.2g 1g H2O 1000ml
K2HPO4
常见的培养四大类微生物的培养基
细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g H2O 1000ml
霉菌（查氏合成培养基） NaNO3 3g K2HPO4 0.01g 蔗糖 30g
1g H2O
KCl 1000ml
0.5g
MgSO4.7H2O
0.5gFeSO4
2）营养协调
培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满 足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用。
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本
沾取标本
接种
灭菌接种环
杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
细菌接种的基本程序
灭菌接种环
取菌种试管和待 接种的斜面试管
沾取标本
接种
接种后灭菌接种环
（四）接种方法
1.平板划线接种法：
目的：使混合的细菌呈单个分
散生长，形成单个菌落，以便 获得纯菌。
放线菌（高氏1号） 淀粉 20g K2HPO4 0.5g NaCl FeSO4 0.01g H2O 1000ml
0.5g
MgSO4.7H2O
0.5g
KNO3
1g
酵母菌(麦芽汁培养基) 干麦芽粉加四倍水，在50℃--60℃保温糖化3-4小时，用碘液试验检查至糖化完全 为止，调整糖液浓度为10。巴林，煮沸后，沙布过滤，调PH为6.0。
c. 氧化还原电位
氧化还原电位又称氧化还原电势（redox potential），是度量 某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势 的一种指标，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。
不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同
好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长,以+0.3～+0.4伏为宜； 厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长； 兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸, +0.1伏以下时进行发酵。
营养培养基
选择培养基 鉴别培养基
用于鉴别不同类型微生物的培养基 微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊 化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特 征变化
厌氧培养基
高压蒸汽灭菌法
• • • • 压力：1.05kg/cm2 温度：121.3℃ 时间：15～30min 效果
–杀死一切微生物， 包括芽胞
3）理化条件适宜
pH 水活度 氧化还原电位
a. pH 培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型 微生物的生长繁殖或产生代谢产物。
通常培养条件：
细菌与放线菌：pH7~7.5 酵母菌和霉菌：pH4.5~6范围内生长 为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入 pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。
方法：
分区划线法：适用于含菌量 较多的标本。 连续划线法：适用于含菌量 较少的标本。
分区划线法
第一区划线
灭菌接种环
第二区划线
灭菌接种环
第三区划线
灭菌接种环
连续划线法
Autoclaving
• 耐高热、不怕潮湿 的物品
高压蒸汽灭菌法的注意事项
包裹适中，垂直放置，留有空隙，容器开盖，勿
装过满，便于流通。 布类物品置于上层，瓶装液体不宜过满（不超过 3/4) 排尽冷气，以免影响蒸汽饱和
灭菌时间达标计算，减压至零，方可取物
灭菌效果，每次检测 注意安全，专人监测 灭菌物品，有效时间两周
培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产 物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。
碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，有时也指培养基中还原糖 与粗蛋白之比。
例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培 养基碳氮比为4/1时，菌体量繁殖，谷氨酸积累少； 当培养基碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷 氨酸产量则大量增加。
高氏1号培养基、查氏培养 基
在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成 为固体状态，琼脂含量一般为1.8%-2.5%
按 物 理 状 态 不 同 划 分
固体培养基 半固体培养基
固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、 活菌计数及菌种保藏
琼脂含量一般为0.2%-0.8%
观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌 体效价滴定
结晶紫 1min 卢戈碘 1min 95%乙 醇30s 稀释复 红 30s
革 兰 染 色
革兰染色结果
油镜下模式图 ×1000
二、细菌的人工培养
根据细菌的生理需要和繁殖规律，用人 工方法为细菌提供营养物质和适宜的环 境条件，使细菌在短时间内大量繁殖， 称为细菌的人工培养。
（一）培养基
培养基是人工配制的，适合细菌生长繁殖或产生代谢 产物的营养基质。 培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础