林业生物技术课件3.原生质体技术

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2、 原生质体的分离
界面法：
酶解产物 +原生质 体培养基
(0.45mol/L 甘露醇)
400g，离心5min
碎片带（轻） 原生体带
0.45mol/L蔗糖
0.45mol/L蔗糖
原理：采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两相 的界面中。
优点：可以收到数量较大的纯净原生质体，同时避免收 集过程中原生质体相互挤压而破碎。
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2、 原生质体的分离
无机盐类或其它化合物
在一些研究中，酶液中还加进一些无机盐 类或其它化合物。如氯化钙、磷酸二氢钾、葡 聚硫酸钾等。由于它们可能对保护细胞膜有一 定的作用，可提高原生质体的稳定性和活力， 防止其破裂。
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调pH值至5.6左右
过滤除菌（0.22～0.45µm）
酶混合液的用量约为10mL/g。
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2、 原生质体的分离
常用的商品化酶制剂
目前，国内国际市场上常用的商品化酶制剂主要有 以下几种，它们各具特点，可根据植物材料的性质 单独使用或搭配使用。 (一)果胶酶 用于降解植物细胞之间的果胶质。常 用的有离析软化酶（Pectolyase Y-23）和离析酶 （Macerozyme）。Pectolyase Y-23的活性较高， 通常用量为0.1%～0.5%。 Macerozyme 的活性稍 低，通常用量为1%～5%.
材料预处理——对于某些植物非常重要。 分离得到的原生质体，其活力和分裂频率高低是影响原生
质体培养成功的2个决定性的因素。
在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以 提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高 某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处 理方法不同。
叶片
常用的原生质 无菌试管苗叶片 体分离材上料胚轴和子叶
培养细胞
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2、 原生质体的分离
叶片——经典材料。
自从1971年Takebe等利用烟草叶肉组织成功 分离出原生质体并使其再生植株以来，利用叶片分 离原生质体已被广泛应用。
一般可能认为选取细胞分裂旺盛的生长点附 近的嫩叶较为合适，但是，许多试验结果表明，选 用充分展开的成熟叶片或生理活性稍稍衰退的过熟 叶片，有利于原生质体的分离及其后的培养。
例如 龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理，甘蔗植株必 须先在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂。
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2、 原生质体的分离
目的：获得大量完好、有活力的原生质体。
机械分离法
原生质体分离方法
机械分离法
酶解分离法
先将细胞放在高渗糖溶液
中预处理，待细胞发生轻微 质壁分离，原生质体收缩成 球形后，再用机械法磨碎组 织，从伤口处可释放出完整
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分
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1.原生质体的研究概况
据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原 生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和 经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植 物向低等植物扩展。
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2、 原生质体的分离
2.1 用于分离原生质体的材料
迄今为止，从植物体的几乎各个部位均有成功地分离出原生 质体的报道。如：幼根、下胚轴、子叶、叶片、茎的髓部、根 瘤、冠瘿瘤、花瓣、花粉、果实组织以及由以上组织或细胞形 成的愈伤组织和悬浮培养细胞等。但是，不同的材料往往会造 成游离的原生质体产量与活力有所不同，甚至会影响到其后的 培养效果。因此，选择适宜的材料是原生质体分离与培养成功 的基础。
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原生质体的研究概况
2
原生质体的分离
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原生质体的培养
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原生质体的融合
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杂种细胞的选择及体细胞杂种植物的鉴定
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思考与讨论 什么是原生质体？如何获得？ 原生质体技术的具体方法步骤？
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1.原生质体的研究概况
1.1 原生质体的概念
原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说 一个被质膜所包围的裸露细胞。
缺点：完整的原生质体的 得率低，适应的植物种类
有限。（基本不用）
的原生质体。用这种方法曾
成功地分离出藻类原生体
（Klercker,1892）。
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2、 原生质体的分离
酶解分离法
用相关酶，降解细胞之间的果胶质，使细胞分离开 来，然后再降解细胞壁（纤维素和半纤维素），获得 原生质（Cocking,1960）。 常用的酶制剂有：果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶
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2、 原生质体的分离
概念：酶解液中，有完整的
原生质体、破碎的原生质体、
2.3 原生质体的收集与纯化 未去壁的细胞、细胞器及其
它碎片。同时，还含有酶及
其它不利于原生质体培养、
完整的原生质体
破碎的原生质体、未去壁的 细胞、细胞器及其它碎片
酶及其它试剂。
伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损 坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否 确定活性。
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2、 原生质体的分离
影响原生质体活力的因素
分离材料的生理状态
酶解条件：酶活力和纯度——浓度、酶解温度、酶解 时间、酶溶液的渗透压
分离条件：纯化方法、离心次数、离心速度、分离持 续时间
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2、 原生质体的分离
渗透压稳定剂
在配制酶液时，必须加入适量的渗透压稳定 剂，以代替细胞壁对原生质体所起的保护作用。 因为细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于低 渗透压的溶液中，就会立即破裂死亡。
甘露醇和山梨醇等糖醇是最常用的渗透压稳 定剂，有时也用葡萄糖。糖醇一般用于游离叶肉 等材料的原生质体。葡萄糖则常用于游离悬浮细 胞的原生质体。渗透压稳定剂的浓度因植物材料 不同而异，一般为0.3～0.7mol/L。
优点：获得大量的原生质体，不受植物种类的限制。
缺点：这些酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物 酶及酚类物质。用酶降解细胞壁，会影响所获原生质 体的活力。
是目前获得原生质体的主要方法。
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2、 原生质体的分离
酶混合液： 酶制剂 + 渗透压稳定剂 + 无机盐类 + 一些其 它化合物
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2、 原生质体的分离
2.4 原生质体活力测定
目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定 原生质体活力。
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，不 能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解 即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜， 因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定 细胞活性。
KM-8P培养基（高国楠，1975）—针对原生质体的培养基。
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3、原生质体的培养
➢ 激素 常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中， 有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质 体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞 核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质
包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原
生质体(miniprotoplast)。
因植物种类而异），除去组织碎片和残渣。 2、将滤液与高渗溶液混合，在900-4500r/min下离心，弃上层碎片溶液，小
心吸取中层原生质体。重复2-3次。 优点：可得到较为纯净、完整的原生质体。 缺点：由于高渗溶液对原生质体常有破坏，因而完好的原生质体少。
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2、 原生质体的分离
飘浮法：常用的飘浮剂有蔗 糖、Percoll（珀可，聚乙 烯吡咯烷酮包被的SIO2颗粒 的无菌胶体悬液）、Ficoll （菲可（水溶性聚糖体））。
采用漂浮法分离（第一次）形成的原生质体带
原理：采用比原生质体比重大的高渗溶液，使原生质体漂浮在溶液表面。 方法： 1、 将含有原生质体的酶液混匀，通过孔径44-169 µm的筛网过滤（孔径大小
再生的试剂。 这些在原生质体培养中会
引起干扰作用，必须清除， 这一过程称为纯化。 即从酶解液中获得纯净原生
酶解液质体的过程。 Nhomakorabea方法：先滤除组织碎片和残
渣，再以新的渗透压稳定剂
或原生质体培养基离心洗涤
2-4次。
主要方法： 漂浮法、界面法
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实和验沉室降法等。
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细胞分化
体细 胞遗 传学
器官发生
原生质体系 统
细胞融 合 外源 DNA
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个体（胚胎） 发生
细胞生 理学
细胞克 隆 7
2、 原生质体的分离
基础材料准备 预处理与酶解 原生质体收集与纯化