林业生物技术课件3.原生质体技术

亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中， 有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质 体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞 核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质
包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原
生质体(miniprotoplast)。
因植物种类而异），除去组织碎片和残渣。 2、将滤液与高渗溶液混合，在900-4500r/min下离心，弃上层碎片溶液，小
心吸取中层原生质体。重复2-3次。 优点：可得到较为纯净、完整的原生质体。 缺点：由于高渗溶液对原生质体常有破坏，因而完好的原生质体少。
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再生的试剂。 这些在原生质体培养中会
引起干扰作用，必须清除， 这一过程称为纯化。 即从酶解液中获得纯净原生
酶解液
质体的过程。
方法：先滤除组织碎片和残
渣，再以新的渗透压稳定剂
或原生质体培养基离心洗涤
2-4次。
主要方法： 漂浮法、界面法
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2、 原生质体的分离
2.1 用于分离原生质体的材料
迄今为止，从植物体的几乎各个部位均有成功地分离出原生 质体的报道。如：幼根、下胚轴、子叶、叶片、茎的髓部、根 瘤、冠瘿瘤、花瓣、花粉、果实组织以及由以上组织或细胞形 成的愈伤组织和悬浮培养细胞等。但是，不同的材料往往会造 成游离的原生质体产量与活力有所不同，甚至会影响到其后的 培养效果。因此，选择适宜的材料是原生质体分离与培养成功 的基础。
处理：在叶片取材之前，通常先对供体植株进 行适当的干旱处理使其处于轻度的萎蔫状态。也可 以对离体叶片的切块先进行质壁分离，这样分离原 生质体的效果更好。
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2、 原生质体的分离
试管苗的子叶、胚轴以及培养的悬 浮细胞具有无菌、不受生长季节影响等 特点。
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2、 原生质体的分离
2.4 原生质体活力测定
目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定 原生质体活力。
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，不 能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解 即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜， 因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定 细胞活性。
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2、 原生质体的分离
渗透压稳定剂
在配制酶液时，必须加入适量的渗透压稳定 剂，以代替细胞壁对原生质体所起的保护作用。 因为细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于低 渗透压的溶液中，就会立即破裂死亡。
甘露醇和山梨醇等糖醇是最常用的渗透压稳 定剂，有时也用葡萄糖。糖醇一般用于游离叶肉 等材料的原生质体。葡萄糖则常用于游离悬浮细 胞的原生质体。渗透压稳定剂的浓度因植物材料 不同而异，一般为0.3～0.7mol/L。
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2、 原生质体的分离
概念：酶解液中，有完整的
原生质体、破碎的原生质体、
2.3 原生质体的收集与纯化 未去壁的细胞、细胞器及其
它碎片。同时，还含有酶及
其它不利于原生质体培养、
完整的原生质体
破碎的原生质体、未去壁的 细胞、细胞器及其它碎片
酶及其它试剂。
例如 龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理，甘蔗植株必 须先在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂。
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2、 原生质体的分离
目的：获得大量完好、有活力的原生质体。
机械分离法
原生质体分离方法
机械分离法
酶解分离法
先将细胞放在高渗糖溶液
中预处理，待细胞发生轻微 质壁分离，原生质体收缩成 球形后，再用机械法磨碎组 织，从伤口处可释放出来自百度文库整
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2、 原生质体的分离
无机盐类或其它化合物
在一些研究中，酶液中还加进一些无机盐 类或其它化合物。如氯化钙、磷酸二氢钾、葡 聚硫酸钾等。由于它们可能对保护细胞膜有一 定的作用，可提高原生质体的稳定性和活力， 防止其破裂。
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2、 原生质体的分离
酶法分离原生质体的步骤
混合酶液 起始材料
酶解（一步法）
叶片为例： 除菌后的叶片
撕去下表皮
切块放入混合酶液中
不时轻摇
25-30℃ 混合酶液转绿
2-4 h
反应液转绿是酶解成功的重要指标，说明已有不少原生质体游离
出来。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受 到更多的损害。
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2、 原生质体的分离
(二)纤维素酶 用于降解植物细胞壁中的纤维素。常用的 有Cellulase Onozuka R-10和Cellulase Onozuka RS。 Cellulase Onozuka R-10几乎为所有的游离原生质体的研 究所采用，而Cellulase Onozuka RS的活性约等于 Cellulase Onozuka R-10的10倍。一般来说，酶的活性越 高，它对植物细胞的毒害也越大，所以，用酶溶液处理的 时间必须相对缩短。
在果树上，主要集中在柑橘上，在这方面华中农业大学园 林学院作了比较多的工作，获得了种间、属间的体细胞杂种。 但这些体细胞杂种再生植株在生产上还没有得到应用。
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1.原生质体的研究概况
1.3 原生质体的研究意义
再生能力
意义： 1、理论研究－膜的 结构与功能。 2、体细胞融合－克 服远缘杂交障碍， 创造新物种。 3、理想受体－导入 外源DNA。
KM-8P培养基（高国楠，1975）—针对原生质体的培养基。
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3、原生质体的培养
➢ 激素 常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D
材料预处理——对于某些植物非常重要。 分离得到的原生质体，其活力和分裂频率高低是影响原生
质体培养成功的2个决定性的因素。
在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以 提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高 某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处 理方法不同。
细胞分化
体细 胞遗 传学
器官发生
原生质体系 统
细胞融 合 外源 DNA
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个体（胚胎） 发生
细胞生 理学
细胞克 隆 7
2、 原生质体的分离
基础材料准备 预处理与酶解 原生质体收集与纯化
原生质体活力测定
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原生质体的研究概况
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原生质体的分离
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原生质体的培养
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原生质体的融合
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杂种细胞的选择及体细胞杂种植物的鉴定
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思考与讨论 什么是原生质体？如何获得？ 原生质体技术的具体方法步骤？
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1.原生质体的研究概况
1.1 原生质体的概念
原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说 一个被质膜所包围的裸露细胞。
伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损 坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否 确定活性。
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2、 原生质体的分离
影响原生质体活力的因素
分离材料的生理状态
酶解条件：酶活力和纯度——浓度、酶解温度、酶解 时间、酶溶液的渗透压
分离条件：纯化方法、离心次数、离心速度、分离持 续时间
许多试验结果指出，利用试管苗作 为供体材料时，苗龄对分离原生质体及 其后培养的效果影响较大。另外，培养 的悬浮细胞，如果经过多次的继代培养， 常常会出现再生植株能力减退和遗传上 的不稳定性等现象。
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2、 原生质体的分离
2.2 材料的预处理与分离
优点：获得大量的原生质体，不受植物种类的限制。
缺点：这些酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物 酶及酚类物质。用酶降解细胞壁，会影响所获原生质 体的活力。
是目前获得原生质体的主要方法。
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2、 原生质体的分离
酶混合液： 酶制剂 + 渗透压稳定剂 + 无机盐类 + 一些其 它化合物
缺点：完整的原生质体的 得率低，适应的植物种类
有限。（基本不用）
的原生质体。用这种方法曾
成功地分离出藻类原生体
（Klercker,1892）。
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2、 原生质体的分离
酶解分离法
用相关酶，降解细胞之间的果胶质，使细胞分离开 来，然后再降解细胞壁（纤维素和半纤维素），获得 原生质（Cocking,1960）。 常用的酶制剂有：果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分
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1.原生质体的研究概况
据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原 生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和 经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植 物向低等植物扩展。
2、 原生质体的分离
飘浮法：常用的飘浮剂有蔗 糖、Percoll（珀可，聚乙 烯吡咯烷酮包被的SIO2颗粒 的无菌胶体悬液）、Ficoll （菲可（水溶性聚糖体））。
采用漂浮法分离（第一次）形成的原生质体带
原理：采用比原生质体比重大的高渗溶液，使原生质体漂浮在溶液表面。 方法： 1、 将含有原生质体的酶液混匀，通过孔径44-169 µm的筛网过滤（孔径大小
环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
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3、原生质体的培养
3.1 原生质体培养基
➢ 无机盐 大量元素浓度； MS或B5中NO3－和NH4+的比例，应适当降低。 Ca2+浓度—高浓度有利于原生质体或再生细胞的分裂。 ➢ 有机成分 维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。
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2、 原生质体的分离
界面法：
酶解产物 +原生质 体培养基
(0.45mol/L 甘露醇)
400g，离心5min
碎片带（轻） 原生体带
0.45mol/L蔗糖
0.45mol/L蔗糖
原理：采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两相 的界面中。
优点：可以收到数量较大的纯净原生质体，同时避免收 集过程中原生质体相互挤压而破碎。
调pH值至5.6左右
过滤除菌（0.22～0.45µm）
酶混合液的用量约为10mL/g。
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2、 原生质体的分离
常用的商品化酶制剂
目前，国内国际市场上常用的商品化酶制剂主要有 以下几种，它们各具特点，可根据植物材料的性质 单独使用或搭配使用。 (一)果胶酶 用于降解植物细胞之间的果胶质。常 用的有离析软化酶（Pectolyase Y-23）和离析酶 （Macerozyme）。Pectolyase Y-23的活性较高， 通常用量为0.1%～0.5%。 Macerozyme 的活性稍 低，通常用量为1%～5%.
(三) 半纤维素酶 用于降解植物细胞壁中的半纤维素。常 用的有Rhozyme HP-150，为加拿大和美国产，此酶主要 用在那些细胞壁中具有半纤维素的植物种类。
(四) 崩溃酶（Driselase），是一种粗制酶，主要含纤维素 酶，也含果胶酶，还混有蛋白酶和核酸酶。使用时应注意 浓度和处理时间。
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叶片
常用的原生质 无菌试管苗叶片 体分离材上料胚轴和子叶
培养细胞
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2、 原生质体的分离
叶片——经典材料。
自从1971年Takebe等利用烟草叶肉组织成功 分离出原生质体并使其再生植株以来，利用叶片分 离原生质体已被广泛应用。
一般可能认为选取细胞分裂旺盛的生长点附 近的嫩叶较为合适，但是，许多试验结果表明，选 用充分展开的成熟叶片或生理活性稍稍衰退的过熟 叶片，有利于原生质体的分离及其后的培养。