Western Blot 的原理,流程及常见问题分析
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去除非特异结合位点：Байду номын сангаас
Blocking Buffer ：3%BSA
5% Milk Room Temperature 1 h
14
步骤六、抗体孵育
一抗的选择 ：
确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。
抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等
注意：抗体的稀释倍数是由底物和目的蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.
2层滤纸
垫片 黑色夹板（负极）
12
56mA /膜 1h
转膜后确认
丽春红 • 可逆染色，检测转膜效率。 • 与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。 蛋白预染Marker • 实时监测
丽春红染色结果
• 分子量参照
• 与目的蛋白同时转秱至印迹膜上，检测 转膜效率。
对转膜后的凝胶进行考染
13
步骤五、封 闭
FITC、Cy2、Dylight488 AMCA
近红外线
Cy5
16
步骤七、检测方法
化学发光法：
HRP酶标系统----ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快； 特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。
化学显色法：
酶标系统HRP----TMB和DAB 酶标系统AP-----BCIP和NBT 特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。
上样前煮沸样品 上样量：30-100 μg 蛋白Marker
8
步骤四、转膜
• 膜的选择：
NC、PVDF、尼龙膜
• 转膜方法：
半干转、湿转
3
• 转膜确认：
立春红染色、蛋白预染Marker
9
膜的选择
10
转秱方法
半干转
• • • • 用滤纸吸Buffer来做转秱体系 适合转秱小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的， 时间是根据 蛋白分子大小定的； 56mA/膜 1h
湿转
• • • • 将膜、胶、滤纸全浸泡在Buffer的Tank里 适合转秱大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h
11
转秱操作
白色夹板（正极） 垫片
膜
滤纸 滤纸 +阳极 -阴极 多孔垫片
300mA 1h
2层滤纸
凝胶
膜（左上角标记）
凝胶（Marker靠左）
17
推 荐
对照设置
内参对照 beta-actin /beta-tubulin/GAPDH
阳性对照 检测一抗是否正常
阴性对照 检测一抗特异性
空白对照 不加一抗，只加二抗，检测二抗是否发生交叉反应。
18
二
Western Blot 技术常见问题分析
19
高背景
原因
膜的污染
解决办法
使用干净镊子；戴手套操作；换一张新膜用 足够的液体，膜始终保持湿润；孵育时使用 脱色摇床；避免膜重叠，互相覆盖；小心操 作，勿毁损膜 增加漂洗时间和缓冲液体积 比较尝试不同封闭液 延长封闭时间 （可4℃过夜） 优化降低一抗、二抗浓度
漂洗不完全 封闭液不适合 封闭不完全 抗体浓度过高
曝光时间过长 缓冲液污染
缩短曝光时间 使用新配制缓冲液
信号弱或无信号
原因
抗原量不足 蛋白质储存过程中降解 转膜不完全 膜错误选择 抗原被封闭液遮蔽 抗体 增加上样量 重新制备样品
解决办法
确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、电极正确装配、 控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间。 选择合适膜的孔径：>22kD 蛋白选用 0.45μm孔径 <22kD 蛋白选用 0.22μm孔径 优化封闭液、缩短封闭时间、减小封闭液中蛋白浓度。 增加抗体浓度、注意抗体储存条件（避免反复冻融）。
曝光时间过短
底物
延长曝光时间
延长底物孵育时间
其他
现象 荧光萃灭快 条带内出现不显影圆点 条带不完整 原因 二抗浓度太高 膜干燥 转膜过程中有气泡 解决办法 降低二抗浓度 保证膜的湿润度 转膜时赶尽气泡
底物孵育不均匀
用保鲜膜均与孵育底物
降低二抗浓度 静置牛奶使大颗粒沉淀
反影（白色条带、黑色背景） HRP浓度过高 散在小圆斑 封闭液有杂质颗粒
4
步骤一、蛋白提取
确定蛋白位置，选择合适的蛋白抽提试剂
防止蛋白质的降解 • 冰上操作 • 加入蛋白酶抑制剂 • Bac-细菌蛋白抽提试剂 • Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 • Yea-酵母蛋白抽提试剂 • Tis-组织蛋白抽提试剂 • Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂
5
步骤二、蛋白定量
Bradford
15
步骤六、抗体孵育
二抗的选择：
根据一抗物种： 抗小鼠 抗兔 抗大鼠 抗人 抗山羊 抗鸡 抗豚鼠 抗马
根据标记物：
标记物
HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记
荧光标记抗体 红色 绿色 蓝色
Cy3、TRITC、RRX、Texas Red X、Dylight549、Dylight 594、 Dylight 649
检测范围：100-1,500 ug/ml
Lowry
检测范围： 1－1500ug/ml
BCA
检测范围：20-2,000 ug/ml
6
BCA定量
梯 度 稀 释
在562nm处有高的光吸收值，
颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。
绘制标准曲线，计算样品中的
蛋白浓度。
7
步骤三、SDS-PAGE 电泳
Western blot 流程和常见问题
主要内容
一、Western Blot 技术原理与实验流程 二、Western Blot 技术常见问题分析
2
Western Blot定义
Western Blot又称免疫印迹，主要是通过电泳将样品中的不同 蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用相应 的抗体来检测目的蛋白的一种方法。
非特异性条带
原因 底物太灵敏 交叉反应 抗原浓度太高 抗体浓度太高 曝光时间太长
解决办法 选择合适的底物 选择单克隆抗体 降低抗原浓度 降低抗体浓度 减少曝光时间
Western Blot 应用目的：
检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中某种蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究
3
Western Blot实验流程
Step1 蛋白提取 Step2 蛋白定量 Step3 SDS-PAGE Step4 转膜 Step5 封闭 Step6 免疫反应 Step7 检测
Blocking Buffer ：3%BSA
5% Milk Room Temperature 1 h
14
步骤六、抗体孵育
一抗的选择 ：
确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。
抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等
注意：抗体的稀释倍数是由底物和目的蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.
2层滤纸
垫片 黑色夹板（负极）
12
56mA /膜 1h
转膜后确认
丽春红 • 可逆染色，检测转膜效率。 • 与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。 蛋白预染Marker • 实时监测
丽春红染色结果
• 分子量参照
• 与目的蛋白同时转秱至印迹膜上，检测 转膜效率。
对转膜后的凝胶进行考染
13
步骤五、封 闭
FITC、Cy2、Dylight488 AMCA
近红外线
Cy5
16
步骤七、检测方法
化学发光法：
HRP酶标系统----ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快； 特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。
化学显色法：
酶标系统HRP----TMB和DAB 酶标系统AP-----BCIP和NBT 特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。
上样前煮沸样品 上样量：30-100 μg 蛋白Marker
8
步骤四、转膜
• 膜的选择：
NC、PVDF、尼龙膜
• 转膜方法：
半干转、湿转
3
• 转膜确认：
立春红染色、蛋白预染Marker
9
膜的选择
10
转秱方法
半干转
• • • • 用滤纸吸Buffer来做转秱体系 适合转秱小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的， 时间是根据 蛋白分子大小定的； 56mA/膜 1h
湿转
• • • • 将膜、胶、滤纸全浸泡在Buffer的Tank里 适合转秱大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h
11
转秱操作
白色夹板（正极） 垫片
膜
滤纸 滤纸 +阳极 -阴极 多孔垫片
300mA 1h
2层滤纸
凝胶
膜（左上角标记）
凝胶（Marker靠左）
17
推 荐
对照设置
内参对照 beta-actin /beta-tubulin/GAPDH
阳性对照 检测一抗是否正常
阴性对照 检测一抗特异性
空白对照 不加一抗，只加二抗，检测二抗是否发生交叉反应。
18
二
Western Blot 技术常见问题分析
19
高背景
原因
膜的污染
解决办法
使用干净镊子；戴手套操作；换一张新膜用 足够的液体，膜始终保持湿润；孵育时使用 脱色摇床；避免膜重叠，互相覆盖；小心操 作，勿毁损膜 增加漂洗时间和缓冲液体积 比较尝试不同封闭液 延长封闭时间 （可4℃过夜） 优化降低一抗、二抗浓度
漂洗不完全 封闭液不适合 封闭不完全 抗体浓度过高
曝光时间过长 缓冲液污染
缩短曝光时间 使用新配制缓冲液
信号弱或无信号
原因
抗原量不足 蛋白质储存过程中降解 转膜不完全 膜错误选择 抗原被封闭液遮蔽 抗体 增加上样量 重新制备样品
解决办法
确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、电极正确装配、 控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间。 选择合适膜的孔径：>22kD 蛋白选用 0.45μm孔径 <22kD 蛋白选用 0.22μm孔径 优化封闭液、缩短封闭时间、减小封闭液中蛋白浓度。 增加抗体浓度、注意抗体储存条件（避免反复冻融）。
曝光时间过短
底物
延长曝光时间
延长底物孵育时间
其他
现象 荧光萃灭快 条带内出现不显影圆点 条带不完整 原因 二抗浓度太高 膜干燥 转膜过程中有气泡 解决办法 降低二抗浓度 保证膜的湿润度 转膜时赶尽气泡
底物孵育不均匀
用保鲜膜均与孵育底物
降低二抗浓度 静置牛奶使大颗粒沉淀
反影（白色条带、黑色背景） HRP浓度过高 散在小圆斑 封闭液有杂质颗粒
4
步骤一、蛋白提取
确定蛋白位置，选择合适的蛋白抽提试剂
防止蛋白质的降解 • 冰上操作 • 加入蛋白酶抑制剂 • Bac-细菌蛋白抽提试剂 • Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 • Yea-酵母蛋白抽提试剂 • Tis-组织蛋白抽提试剂 • Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂
5
步骤二、蛋白定量
Bradford
15
步骤六、抗体孵育
二抗的选择：
根据一抗物种： 抗小鼠 抗兔 抗大鼠 抗人 抗山羊 抗鸡 抗豚鼠 抗马
根据标记物：
标记物
HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记
荧光标记抗体 红色 绿色 蓝色
Cy3、TRITC、RRX、Texas Red X、Dylight549、Dylight 594、 Dylight 649
检测范围：100-1,500 ug/ml
Lowry
检测范围： 1－1500ug/ml
BCA
检测范围：20-2,000 ug/ml
6
BCA定量
梯 度 稀 释
在562nm处有高的光吸收值，
颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。
绘制标准曲线，计算样品中的
蛋白浓度。
7
步骤三、SDS-PAGE 电泳
Western blot 流程和常见问题
主要内容
一、Western Blot 技术原理与实验流程 二、Western Blot 技术常见问题分析
2
Western Blot定义
Western Blot又称免疫印迹，主要是通过电泳将样品中的不同 蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用相应 的抗体来检测目的蛋白的一种方法。
非特异性条带
原因 底物太灵敏 交叉反应 抗原浓度太高 抗体浓度太高 曝光时间太长
解决办法 选择合适的底物 选择单克隆抗体 降低抗原浓度 降低抗体浓度 减少曝光时间
Western Blot 应用目的：
检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中某种蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究
3
Western Blot实验流程
Step1 蛋白提取 Step2 蛋白定量 Step3 SDS-PAGE Step4 转膜 Step5 封闭 Step6 免疫反应 Step7 检测