ICC免疫细胞化学染色
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。
免疫实验-ICC用细胞抗原的制备
ICC用细胞抗原的制备一、材料和试剂1、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；ddH2O 至1000ml ；高压灭菌,分装。
2、0.25%胰酶：称取EDTA 0.02g NaCl 0.8g KCl 0.04g 加三蒸水100ml溶解后加0.25g 胰酶,轻轻搅动,使胰酶溶解,不要产生泡沫,加酚红少许,调PH值到8.2-8.6,过滤除菌,分装10ml/管,-20℃保存,临用前预温到37℃。
3、诱导液(TPA)：12-邻-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA)溶于丙酮，配成20mg/ml。
1、HFF,NIH3T3细胞用含10%血清DMEM完全培养液在75cm2培养瓶中单层培养,使密度达到90%2、倾去培养液,用无菌PBS液5-10ml洗细胞一次,用无菌吸管吸干PBS液。
3、加0.25%胰酶(从-20℃取出,在37℃预温)75平方厘米培养瓶加1ml,37℃温箱或有经验者可在酒精灯周围,控制温度约37℃左右,轻轻摇匀使胰酶充分覆盖细胞表面。
4、观察到细胞有松动,成流沙状下落;或在显微镜下观察,细胞已有收缩变圆时,用无菌PBS液15-20ml,终止反应。
5、轻轻吹打下细胞,使细胞单个分散,并充分混匀1500转/分离心5-10分钟,去掉上清液6、打散细胞,加10ml含血清DMEM完全培养液混匀,取10ul在显微镜下计数,计算细胞浓度。
7、用含10%血清培养液调整细胞浓度至1×104个/100ul,每孔(96孔)接种200ul(即2×104个细胞/孔),37℃CO2培养箱培养。
8、次日显微镜下观察,细胞是否完全贴壁(一般24小时可完全贴壁)倒去培养0.01M PBS液先二次(孔中加满PBS,轻轻倒掉)并在滤纸上扣干,反复3次)应注意加液的力度,不能太大,以免冲掉细胞,倒去上清液在滤纸上扣干水份,但保持细胞湿润。
免疫组织化学染色SP技术
18
武汉大学病理教研室
一抗孵育时间及抗体选择
应选择信誉高、质量好的试剂公司 抗体切忌反复冻融 一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度 按说明书可采用 37℃ 1-2 小时或 4℃ 冰箱过夜
19Biblioteka 武汉大学病理教研室检测及显色系统
一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的
检测方法。如SP、LSABC、ABC等
显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测
20
武汉大学病理教研室
显色系统
常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP) A:显色底物DAB-----棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-----砖红色 2.碱性磷酸酶(AP) 显色底物:BCIP/NBT----蓝紫色
21
武汉大学病理教研室
25
武汉大学病理教研室
免疫组织化学的应用
IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞 间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的 正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理， 广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的 检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表 型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞 周期和信号转导的研究等。
2
武汉大学病理教研室
13
武汉大学病理教研室
实验操作中的应用
抗原修复 实验操作中的注意事项
14
武汉大学病理教研室
抗原修复
影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类
1）酶消化法 2）加热法（高压法›水煮法›微波法）
抗原修复液的选择
1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0）
6
武汉大学病理教研室
7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵 育 过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；
抗原修复方法及注意事项
抗原修复方法及注意事项在免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）等实验技术中，抗原修复是一个至关重要的步骤。
它对于提高抗原的检测敏感性和特异性，获得准确可靠的实验结果具有重要意义。
接下来，让我们详细了解一下抗原修复的方法以及在操作过程中需要注意的事项。
一、抗原修复的概念抗原修复，简单来说，就是通过一系列的处理方法，使在组织固定和处理过程中被封闭或破坏的抗原决定簇重新暴露出来，从而能够与抗体发生特异性结合，被检测到。
二、抗原修复的方法（一）热诱导抗原修复（HIER）这是目前应用最为广泛的方法之一。
1、水浴加热法将切片浸泡在装有修复液的容器中，然后置于水浴锅中加热。
通常温度设定在 95 100℃，时间一般为 15 20 分钟。
2、高压加热法把切片放入装有修复液的高压锅中加热。
这种方法能在较短时间内达到较好的修复效果，一般加热 2 3 分钟，压力维持在 10 13 个大气压。
3、微波加热法将切片放入装有修复液的容器中，然后放入微波炉中加热。
加热时间和功率需要根据具体情况进行调整，一般为 5 15 分钟。
（二）酶消化法常用的酶包括蛋白酶 K、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。
酶的浓度和作用时间需要根据组织类型和抗原特性进行优化。
（三）非加热抗原修复法例如使用某些化学试剂，如尿素等，来实现抗原修复。
三、抗原修复液的选择常见的抗原修复液有柠檬酸盐缓冲液（pH 60）、EDTA 缓冲液（pH 80 90）和 TrisEDTA 缓冲液（pH 90）等。
不同的修复液对于不同的抗原和组织具有不同的效果，需要根据实验条件进行选择。
四、抗原修复的注意事项（一）组织切片的准备切片的厚度要适中，一般为 3 5 微米。
过厚的切片可能导致修复不均匀，过薄的切片则容易在操作过程中受损。
（二）修复液的配制要严格按照配方准确配制修复液，确保 pH 值和浓度的准确性。
同时，修复液要新鲜配制，避免长时间存放导致失效。
（三）温度和时间的控制这是抗原修复的关键因素。
免疫细胞成像ICCIF实验流程指南-ThermoFisherScientific
免疫细胞成像 ICC/IF 实验流程指南帮您获取最优质的出版级细胞图像目录概述 (1)实验流程概览 (2)细胞准备 (4)固定/透化/封闭 (5)免疫标记 (8)多色检测 & 复染 (12)信号优化 (20)相关资源 (22)2概述免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)是一种常用的实验技术，它通过使用抗原抗体特异性结合反应，提供了一种半定量的方法来分析靶抗原的相对丰度、构象和亚细胞定位。
研究样本通常是培养的细胞系、原代细胞，或者从病人和动物身上获得的悬浮细胞，包括细胞爬片、血液涂片、拭子和抽取物等。
传统的ICC技术使用显色法检测，酶结合抗体将显色底物在反应位点转化为有色沉淀。
然而，随着免疫荧光标记(Immuno uorescence, IF)的出现，越来越受到广泛的应用，在很多情况下，常常把ICC/IF(免疫细胞化学/免疫荧光)放在一起使用。
在我们的官网和本手册中，ICC通常也用于描述IF。
在ICC/IF分析中，细胞抗原可以用荧光直接标记的一抗(直接法检测)或二抗及酶偶联物等(间接法检测)来显示。
通过结合不同荧光标记抗体，多重ICC/IF还可以同时检测同一样品中的多种抗原。
Invitrogen™ Molecular Probes™ 荧光试剂作为备受全球科学家认可的品牌，专注荧光标记及检测领域40多年，可提供经过长期验证过的各种荧光染料及相关试剂，帮您获得可靠的高品质出版级实验结果图像。
/probes1实验流程概览12 23454产品名称规格货号简介CultureWell ™ Multiwell Chambered Coverslip 1 set C24776成像用玻片、盖玻片、多孔垫片，及相关辅助小工具，每种都有更多品类CoverWell ™ Incubation Chamber Gasket 25 gaskets C18150Press-to-Seal ™ Silicone Isolator with Adhesive 1 set P24740Secure-Seal ™ Spacer 8 wells 1 set S24737Coverglass Removal Tool1 each C37010Coverslip Mini-Rack for 8 coverslips 玻片架1 eachC14784细胞准备健康的细胞是后续实验的基础，至关重要。
免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库
免疫组化的相关知识！一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
四、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色（IHC）定义：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化检测标本1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。
免疫组化操作步骤①石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。
2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1 h，80%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各1 h3、透明：1:1无水乙醇二甲苯溶液30 min，二甲苯溶液中10 min（组织块透明即可）。
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色(Immunohistochemical Staining,IHC)是一种常见的组织学检测方法，用于确定细胞或组织中特定蛋白质的表达或位置。
这种技术实际上是将抗原源合成出抗体，利用免疫相互作用(两抗体一抗原)在细胞内或细胞外测定有无抗原物质。
这种技术有许多种变式，其中一种叫做实时双标定量免疫组织化学染色(RQ-IHC)，可以用来检测癌细胞内外的抗原表达。
染色十分具体：首先，切取患者的取样以供检测，然后将组织片放在真空显微镜的底部，将抗体滴在表面上并使其完全覆盖，然后将片子放置在一定温度的溶液中培养，以促成抗体和抗原之间的结合。
最后，借助细胞标记小分子，将抗原特异性滴在含抗体片上，以实现染色。
此外，还可以使用磁珠，是特殊磁性微球，将抗体带入抗原，从而改善抗体和抗原的结合，从而提高染色的特异性。
IHC 染色为临床检测提供了重要佐证，在临床组织活检及肿瘤监测中有着重要的作用。
它可以帮助医生的诊断和行医判断，帮助选择治疗方法，更好地控制肿瘤的发展，最大限度地减小病人的痛苦。
IHC 染色在其他方面也有重要应用，尤其是在器官移植和临床药物开发中，它能够有效提高细胞和组织质量，并帮助研究者准确地检测细胞和组织中蛋白质的表达。
通过IHC 染色，可以帮助我们准确了解细胞组织的结构和异常状态，从而改善对各种疾病的辅助检测、诊断和治疗。
这一技术为临床医生提供了坚实的诊断成果，给患者带来了良好的治疗效果。
immunohistochemistry 免疫组化
维持切片片湿度
Sangon Antibody R&D Center
四、操作步骤
（一一）石石蜡切片片免疫组化步骤： 1. 组织固定：将切片片置于60°C恒温箱中烘烤60分钟。
2. 脱蜡：将切片片用用二二甲苯浸泡10分钟，更换二二甲苯后再浸泡10分钟。 3. 水水化：分别用用无无水水乙乙醇浸泡5分钟；95%乙乙醇中浸泡5分钟；85%乙乙醇中浸泡5分钟；75%乙乙醇中浸泡5分钟。 4. 洗涤：ddH2O浸泡5分钟，清洗3次。 5. 抗原修复：（免疫组化石石蜡切片片） 经福尔⻢马林等固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构，蛋白白多肽发生生交联，导致部分抗原表位封闭，结合位点减少，所以需要 抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露抗原，以不出现明显脱片片现象为佳。 抗原修复的几几种常用用方方法（仅供参考） （1）.微波炉加热 在微波炉里里加热0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至至沸腾后将组织芯片片放入入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。根据玻片片情况可参考 采用用微波加热“3-5-3法”，3分钟温火火沸腾后静止止5分钟，再温火火沸腾3分钟即可。 （2）. 沸热修复 电炉或水水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至至95℃左右，放入入组织芯片片加热10-15分钟。待溶液冷却至至室温后取出切片片。 （3）. 高高压热修复 在沸水水中加入入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0），盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片片置于金金属染色色架上，缓慢加 压，使玻片片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子子锁定，小小阀⻔门将会升起来。10分钟后除去热源，置入入凉水水中，当小小阀⻔门沉下去后打开盖 子子。待溶液冷却至至室温后取出切片片。此方方法适用用于较难检测或核抗原的抗原修复。（骨骨及软骨骨组织的标本最好选择较温和的微波加热修 复）。 （4）. 酶消化方方法 常用用0.1%胰蛋白白酶和0.4%胃蛋白白酶液。胰蛋白白酶使用用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen，GFAP， Complement，Cytokeratin，c-erB-2，LCA，LN等。 6. 洗涤：ddH2O浸泡5分钟，清洗2次，PBST浸泡5分钟，清洗2次 7. 灭活酶：每张切片片滴加50 μl灭活酶试剂，室温避光处理15分钟。 8. 洗涤：ddH2O浸泡5分钟，清洗2次，PBST浸泡5分钟，清洗2次。 9. 封闭：每张切片片滴加含3% BSA-PBST 50 μl，湿盒中室温封闭30分钟。 10. 孵育一一抗：弃去封闭液，每张切片片滴加50 μl一一抗，4℃湿盒中孵育过夜或37°C 1小小时。 11. 复温：次日日取出切片片，室温复温40分钟。 12. 洗涤：PBST浸泡5分钟，清洗3次。（第一一次迅速倒掉）。 13. 孵育二二抗：每张切片片滴加HRP标记的二二抗25μl，室温或37°C孵育30分钟。
免疫细胞成像ICCIF试验流程指引
免疫细胞成像 ICC/IF 实验流程指南帮您获取最优质的出版级细胞图像目录概述 (1)实验流程概览 (2)细胞准备 (4)固定/透化/封闭 (5)免疫标记 (8)多色检测 & 复染 (12)信号优化 (20)相关资源 (22)2概述免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)是一种常用的实验技术，它通过使用抗原抗体特异性结合反应，提供了一种半定量的方法来分析靶抗原的相对丰度、构象和亚细胞定位。
研究样本通常是培养的细胞系、原代细胞，或者从病人和动物身上获得的悬浮细胞，包括细胞爬片、血液涂片、拭子和抽取物等。
传统的ICC技术使用显色法检测，酶结合抗体将显色底物在反应位点转化为有色沉淀。
然而，随着免疫荧光标记(Immuno uorescence, IF)的出现，越来越受到广泛的应用，在很多情况下，常常把ICC/IF(免疫细胞化学/免疫荧光)放在一起使用。
在我们的官网和本手册中，ICC通常也用于描述IF。
在ICC/IF分析中，细胞抗原可以用荧光直接标记的一抗(直接法检测)或二抗及酶偶联物等(间接法检测)来显示。
通过结合不同荧光标记抗体，多重ICC/IF还可以同时检测同一样品中的多种抗原。
Invitrogen™ Molecular Probes™ 荧光试剂作为备受全球科学家认可的品牌，专注荧光标记及检测领域40多年，可提供经过长期验证过的各种荧光染料及相关试剂，帮您获得可靠的高品质出版级实验结果图像。
/probes1实验流程概览12 23454产品名称规格货号简介CultureWell ™ Multiwell Chambered Coverslip 1 set C24776成像用玻片、盖玻片、多孔垫片，及相关辅助小工具，每种都有更多品类CoverWell ™ Incubation Chamber Gasket 25 gaskets C18150Press-to-Seal ™ Silicone Isolator with Adhesive 1 set P24740Secure-Seal ™ Spacer 8 wells 1 set S24737Coverglass Removal Tool1 each C37010Coverslip Mini-Rack for 8 coverslips 玻片架1 eachC14784细胞准备健康的细胞是后续实验的基础，至关重要。
免疫细胞化学技术经验
精心整理免疫细胞化学技术一、免疫细胞化学技术的概述*免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，(一)*-*-(二) *--*-完全抗原：分子量较大，一般在10kDa 以上，并具有较复杂的化学组成。
*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。
例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载 体*通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。
结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体(antibody,Ab)1*抗体。
---2*-*B淋巴--多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备*动物的选择*佐剂(adjuvant)*免疫方法*免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血(1) 动物的选择选择什么动物来免疫取决于：*所需抗血清的量-*-小鼠(1)*--)为最常用。
(2)**-弗氏不完全佐剂(Freund'sincompleteadjuvant)-弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant)弗氏不完全佐剂(Freund'sincompleteadjuvant,FIA)*是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
免疫组化特点
免疫组化特点引言免疫组化是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术方法。
通过利用抗体与组织或细胞中的特定抗原结合的特性，免疫组化可以精确定位和定量分析目标分子的表达和分布情况。
本文将全面、详细、完整且深入地探讨免疫组化的特点和相关应用。
文章将从免疫组化的原理、方法、优势和局限性等多个方面进行阐述。
原理免疫组化的原理基于抗原与抗体的特异性相互作用。
抗体是免疫系统中产生的一类特异性蛋白质，可以与抗原结合形成抗原-抗体复合物。
免疫组化利用这种特性，通过将组织或细胞中的靶抗原与与之特异性结合的抗体发生免疫反应，从而实现目标分子的检测和定位。
方法免疫组化的方法主要包括免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）。
IHC主要用于检测和定位组织中的蛋白质抗原，而ICC主要用于检测和定位细胞中的蛋白质抗原。
免疫组织化学（IHC）1.固定组织样本：通过适当的固定剂和处理条件，使组织中的细胞和细胞内结构固定。
2.抗原检出：使用特异性的一抗（一级抗体）与目标分子抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
3.标记二级抗体：与第一抗体结合的二级抗体被标记上酶、荧光染料或放射性同位素等探针，以便可视化目标分子。
4.染色和显色：通过与标记二级抗体相互作用，使目标分子表达的位置染色，例如使用酶底物进行显色。
5.显微镜观察和图像分析：使用显微镜观察染色结果，并对图像进行定量分析和解读。
免疫细胞化学（ICC）1.固定细胞样本：通过适当的固定剂和处理条件，使细胞中的蛋白质抗原固定。
2.细胞渗透处理：使用洗涤剂等进行细胞膜的渗透，以便抗体能够与细胞内的目标分子结合。
3.同样的步骤2-5与IHC类似。
优势免疫组化具有许多优势，使其成为生物医学研究和临床诊断中广泛应用的技术方法。
高特异性免疫组化通过特异性抗体与特定抗原的结合，能够非常精确地定位和检测目标分子。
这种高特异性使免疫组化能够区分目标分子与其他相关分子的差异，并在组织或细胞级别上提供定量信息。
免疫细胞化学染色在骨髓涂片诊断中的应用
免疫细胞化学染色在骨髓涂片诊断中的应用【摘要】目的：分析免疫细胞化学染色在骨髓涂片诊断中的应用价值。
方法：在骨髓涂片上直接进行免疫细胞化学标记进行明确诊断。
结果：结合免疫细胞化学，可达到准确鉴别诊断的要求。
结论：应用免疫细胞化学技术对肿瘤性骨髓涂片进行抗原标记，取得了良好的效果，有助于明确疾病的鉴别诊断。
【关键词】骨髓检查；免疫组织化学；诊断免疫组化在外科病理学上已经被广泛应用，但常规应用于细胞学上还不多，而在细胞病理学中面临的主要问题是弄清细胞的来源和性质，传统的形态学方法和标准能满足多数分化细胞的分类和诊断，但对难以辨认的肿瘤细胞，免疫细胞化学（ICC）在细胞病理学中是一很有用的辅助诊断方法，结合免疫细胞化学，可达到准确鉴别诊断的要求。
但多数免疫细胞化学在胸腹水恶性肿瘤的应用，在骨髓涂片上直接进行免疫细胞化学标记进行明确诊断少见报道。
笔者应用免疫细胞化学技术对肿瘤性骨髓涂片进行抗原标记，取得了良好的效果，有助于明确疾病的鉴别诊断。
1 临床资料1.1 一般资料选取我院10例患者恶性骨髓涂片，骨髓涂片诊断尚有困难或怀疑有其他转移性肿瘤但又无法活检明确诊断的骨髓涂片。
1.2 试剂小鼠抗人CK、CD20、CD79a、CD3、CD43、CD45RO、CD56、Syn、LCA、及MaxVision试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。
1.3 免疫细胞化学方法（1）根据临床病史及常规HE初步诊断，对抗体筛选不同抗体的标记；（2）观察骨髓涂片细胞量（除红细胞）较多的区域，并用免疫组化笔划圈直径约1cm，太小细胞量少且玻片容易干燥，过大浪费抗体；（3）骨髓涂片放入乙醇乙醚固定液固定5min，水洗5min，PBS液冲洗，一抗室温孵育1h；PBS液冲洗，二抗室温孵育15min；PBS液冲洗，DAB显色；PBS代替一抗作阴性对照。
最后苏木精复染，中性树胶封固。
取骨髓液3-5ml肝素抗凝，Ficoll液分离单个核细胞，用PBS洗涤3次，调细胞浓度为1-2×106/ml，甩片凉干。
免疫组化(IHC)标准化
免疫组化（IHC）标准化云南省第三人民医院病理科徐开军免疫组化（IHC）是病理诊断的主要辅助手段之一。
虽然免疫组化在各个实验室已经常规开展，但是由于各个实验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化实验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异。
免疫组化染色技术操作步骤看似简单，但步骤较多且环环相扣，而且许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修复及修复液的PH值等众多因素。
所以，完成一张满意的免疫组化切片并非那么简单。
20世纪末，非生物素型聚合物（Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化实验室广泛应用。
当前，免疫组化技术标准化的讨论是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并使用非生物素型聚合物检测方法的基础上而展开的。
1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。
（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败，凝固或沉淀组织、细胞内物质，以保持组织和细胞固有形态和结构。
对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原，防止抗原破坏和弥散。
需高度重视的是手术或穿刺离体组织必须马上放于标本袋固定，固定后应与病理申请单及时送交病理科。
病理医生有责任与手术送检科室进行必要的配合与沟通，避免手术后的病理标本随意丢放。
由于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不同固定剂的特征。
常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。
由于中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此推荐作为病理标本的首选固定液。
应避免使用含重金属的固定剂。
10%中性缓冲福尔马林配制方法：40%甲醛100ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠 6.5g蒸馏水900ml固定液的量一般为组织块总体积的5-10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本为18-24小时。
免疫组织化学（IHC）染色方法
免疫组织化学（IHC）染色方法来源：网络免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织和细胞中的某些化学物质的一门技术，它是免疫学和传统组织化学相结合而形成的。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
免疫组织化学染色方法IHC染色方法有很多种，按部标记物的性质可分为荧光法（荧光素标记），酶法（辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶），免疫金银及铁标记技术等；按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步，三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如PAP法和标记的葡聚糖聚合物（labeled dextran polymer,LDP）法，以及亲和连接，如ABC法、标记的链亲和素-生物素（labeled streptoavidin-biotin ,LSAB）法等，其中LSAB是最常用的使用方法。
免疫组化染色的质量控制和结果解析HIC中常用的抗原表达模式有以下几种：①细胞质内弥漫性分布。
如脑垂体前叶ACTH等各种细胞功能成分和滤泡细胞等均为弥漫性胞质染色；②细胞核周的胞质内分布，其判别要点是细胞核的轮廓被勾画得很清楚；③胞质内局限性点状阳性，如CD15抗体的染色；④细胞膜线性阳性，大多数淋巴细胞标记的染色如此，如CD20、CD45RO；⑤细胞核阳性，如Ki-67及雌孕激素受体蛋白ER、PR等。
一种抗体可同时出现细胞质和细胞膜的阳性表达，如EMA可呈膜性和胞质内弥漫性阳性反应；CD30抗体可同时呈膜性和胞质内点状阳性反应等影响免疫组化染色质量的因素很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当的选择和使用封闭和抗原修复手段，严格的技术操作和对照等。
ICC
IF/ICC Q & A 免疫细胞(组织)化学实验中如何选择固定剂？ 固定剂主要有两类：一类是有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙 酮等。
它们通过强烈脱水变性蛋白，同时它们也能够溶解脂类 物质，因此产生通透效应。
另一类为交联剂，如甲醛、多聚甲 醛、戊二醛等，它们导致细胞内分子相互连接成网状结构，从 而维持在原位上。
这两类固定剂各有优缺点，交联剂比有机溶 剂更易于保持细胞的结构，但交联可能会破坏一些细胞组分的 抗原性。
同时交联剂固定的细胞需要通透处理，才能让抗体穿 越膜结构与胞内抗原结合。
醇类固定的优势在于蛋白变性完全， 对抗原的保存性好，能充分暴露出抗原。
醇类固定的细胞不需 要再通透。
在免疫细胞(组织)化学实验中选择哪种固定方法，先要考 虑所检测抗原在细胞中的定位，通常膜组分的蛋白需要用多聚 甲醛固定。
其他蛋白往往凭经验选择固定剂，可以试用两种方 法，然后选择较好的一种。
免疫荧光，免疫细胞化学和免疫组织化学实验如何设置对照？ 设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除 非特异性疑问，同时对照的设立也有助于判断实验中出现的问 题。
（1）阴性对照 阴性对照可以了解背景荧光和非特异性染色，当待检 标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。
较理想的阴性对照检测遗传背景相同但仅仅不表达所研究抗原 的细胞，例如把某个蛋白已敲除的细胞或动物组织样品。
但这 样的标本不一定存在或很难找到，常见的阴性对照也可以是针 对一抗的 PBS 对照或来自同一种属动物的血清对照。
（2）阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染 色，这种阳性对照可验证 Protocol，排除实验过程中出现的差 错。
另一种阳性对照可以是在细胞内过表达所研究的抗原。
同 时也可以在这个抗原上接上商业化的表达标签，如 Flag, Myc, His tag 等。
什么是免疫荧光双标记，怎么进行荧光双标实验？ 免疫荧光双标记（Double Immunofluorescence）是用两种 不同荧光染料标记的抗体同时检测两种抗原。
免疫组化抗体选择及常用染色方法
免疫组化抗体选择及常用染色方法一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
二、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
原代培养海马细胞神经元的鉴定
将大鼠海马神经元细胞终浓度（2*106个/ml）接种于铺有盖玻片并经多聚赖氨酸包被好的6孔板中，每孔，培养条件同上，培养至第8天，用免疫组化法鉴定。
步骤如下：
1.吸弃培养液用PBS冲洗3遍，冷丙酮固定10min。
冲洗3遍，3%H2O2（30%双氧水和纯甲醇按1:9的容积比混合）封闭内源性过氧化物酶，室温下10min。
冲洗3遍，%Triton破膜（溶解细胞膜，细胞核膜细胞器膜上的脂质）15min，PBS洗3遍。
%羊血清封闭，室温10min，吸弃上清（不洗）。
一抗37℃反应1h（20μL的NSE+1ml稀释液），设空白对照，以PBS代替一抗
洗3*5min，二抗（羊抗兔）室温下18min，PBS洗3*5min，SABC复合物37℃，18min。
（二抗标记的FITC在紫外光激发下显色）
洗3*5min，DBA显色（5min）。
镜下观察，自来水终止。
DBA稀释度（1:50），苏木素复染（3min），95%乙醇脱水，二甲苯透明20min，中性树胶封固，风干，镜下观察。
注：PBS用的（配置成的，用时稀释）。