去内毒素质粒提取DNA操作流程
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
20ug去内毒素质粒提取DNA操作流程
注意：提质粒整个过程要用灭菌枪头和灭菌管，所有试剂要用灭菌枪头吸；
10-20ug质粒提取只用一个蓝色质粒过滤柱；
试剂：solutionⅠ加酶后和BufferN3要放在4℃冰箱。
转化用stBl3感受态
1.转化：取质粒1ul加stBl3感受态50ul,冰浴30min，热击45秒-60秒，冰浴2min，加
SOC 400ul，放在摇床摇1小时，划线，放在37℃恒温箱过夜
2.接菌
早上开始上班时，把平板取出，挑单菌落到1ml试管中，放到摇床摇。摇到下班前接到5ml试管中，20ug质粒接3支试管
3.把试管放到37℃恒温摇床摇过夜（大约16小时）
4.收获细胞：
试管在37℃恒温摇床取出，移到40ml离心管收菌（每种样品一个管，注：40ml 管最多只能装7支5ml试管），用天平调平，离心（3500转/分 10分钟或8000转/分 2分钟），弃去上清液，加350ulsolutionⅠ(溶液Ⅰ)，震荡混匀至沉淀重悬，把重悬液移至5ml 管中。
5.加350ul solutionⅡ(溶液Ⅱ)，温柔上下颠倒至溶液变清，加175ul BufferN3，上下颠倒，放在-20℃冰箱放置10min,离心12000rpm/min 10min，把上清液移到5ml管中。
6.DNA结合：
7.加入1ml ETR Binding Buffer, 上下颠倒大约20次，混合后移至Higbind(蓝色质粒过
滤柱，每个装660ul，每个
质粒1个柱)离心12000rpm/min 30’s弃去滤液（过完为止）。
8.DNA洗柱：
加250ulETR wash Buffer洗柱，离心12000rpm/min 1min，弃去滤液，加250ul BufferEHB 洗柱，离心12000rpm/min 1min，弃去滤液, 加700ul DNA wash Buffer洗柱，离心12000rpm/min 1min弃去滤液(重复一次)，倒去滤液空管离心12000rpm/min 3min。
9.把柱放在进口1.5ml ep管中，加60ul细菌内毒素检查用水（要用灭菌枪头加），放置
2min离心12000rpm/min 2min。
10.测浓度：记录浓度和260：280（纯度），交QC和记录数据。
11.纯度要求：1.80-1.87
12.质粒浓度：500ng/ul以上，体积40-60ul