第四章免疫学检测技术

免疫学检测技术
中卫市第一人民医院 魏玉红
一、免疫学检验原理


抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发 生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在 于血清中，故又称血清学反应（serological reaction) 应用：
• 用已知抗原检测未知抗体；
• 用已知抗体检测未知抗原： • 定性或定量检测体内各种分子；
抗链球菌溶血素“O”（ASO）
原理：
胶乳凝集试验原理相同，在受检者 血清中，加入溶血素“O”,出现凝集颗粒， 即为阳性。 参考值： ASO≤250U/L
抗链球菌溶血素“O”（ASO）
临床意义： 1.ASO测定对于诊断A族链球菌感染很有价值，其存在 及含量可反映感染的严重程度。 2.风湿热、急性肾小球肾炎、结节性红斑、猩红热、 急性扁桃体炎等ASO明显升高。 3.少数肝炎、结缔组织病、结核病及多发性骨髓瘤病 人亦可使ASO增高。 4.当效价>250U/L时，才被认为有诊断价值。
胶乳凝集试验
方法：


传统的胶乳凝集试验分试管法与玻片法。 试管法先将受检标本在试管中以缓冲液作倍比稀释， 然后加入致敏的胶乳试剂，反应后观察胶乳凝集结 果。 玻片法操作简便，1滴受检标本和1滴致敏的胶乳试 剂在玻片上混匀后，连续摇动2～3min即可观察结果。 出现大颗粒凝集的为阳性反应，保持均匀乳液状为 阴性反应。
试验原理
作用原理：利用补体的溶细胞作用进行各种
物理状态的抗原抗体测定 5种成分，3个系统
溶 反应系统（溶菌系统）：已知抗原（或抗体） 菌 与待测抗体（或抗原） 补体系统： 系 指示系统（溶血系统）：SRBC与相应溶血素。 统
试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞 （sensitized sheep red blood cell,SRBCS）。
用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等 标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测，是
目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与
抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性， 具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优 点。
1．免疫荧光法(immunofluorescence, IF)
用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待 检标本中抗原反应，臵荧光显微镜下观察，抗 原 - 抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定
2.比例性
结合价： 天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与 多个抗体分子结合，为多价。单体形式的抗体分 子有两个 Fab 段，能结合两个相同的抗原决定基， 为两价。

比例合适：
若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个 Fab 段 分别与两个抗原决定基结合，相互交叉连接成网格状复合 体，则反应体系中基本不存在游离的抗原或抗体，此时形 成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。 因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。
补体结合试验
（Complement Fixation test, CFT)
敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多， 现在已有被其它新方法取代的趋势。
补体结合试验(complement fixation test，CFT ) 将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反 应
系统中抗原或抗体的传统方法。
形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。
用于沉淀反应中的抗原称沉淀原(precipitonogen)。 用于沉淀反应中的抗体称沉淀素（precipitin) 。

大多沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质 进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与 抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形 成可见的白色沉淀。
1.凝集反应
2.沉淀反应
3.补体参加的反应
4.免疫标记技术
反应类型 非 标 记 凝集反应 沉淀反应
实验技术 直接凝集试验、间接凝集试验、间接 抑制凝集试验、协同凝集试验 液相内凝集试验、凝胶内凝集试验
补体参与的反应
中和反应 标 记 标记免疫反应
补体溶血试验、补体结合试验
病毒中和试验、毒素中和试验 荧光免疫技术 放射免疫技术 酶免疫技术
胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique) 是以胶体金作为示踪标记物，应 用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。
免疫胶乳试验应用
胶乳凝集试验
原理：
胶乳凝集试验是一种间接凝集试验，它是以聚 苯乙烯胶乳微粒作为惰性载体。胶乳为人工合成的 载体，因此其性能比生物来源的红细胞稳定，均一 性好。但胶乳与蛋白质的结合能力以及凝集性能不 如红细胞，因此作为间接凝集试验，胶乳试验的敏 感度不及血凝试验。
该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长
激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、 IgE等。
免疫放射分析法（immunoradiometric assay, IRMA） 属于非竞争性放射性配体结合分析技术。他与 RIA为代表的竞争性放射性配体分析技术的区别主 要有两点：一，放射性核素标记的是抗体而不是抗 原，其二是采用过量抗体而不是限量抗体。RIMA与 RIA相比较，提高了检测的灵敏度并使检测范围增 宽，特异性和精确度进一步提高。
免疫放射分析法有以下特点：
1.以标记抗体作为示踪剂 2.反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争性 的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIA快。 3.灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的 10～100倍。 4.标准曲线工作范围宽。 5.特异性高。 6.稳定性好。
４．金标记免疫技术
1．直接凝集（direct agglutination) ： 细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或 红细胞凝集现象。 2．间接凝集（indirect or passive agglutination) ： 检测针 对可溶性Ag的Ab 3．间接凝集抑制试验 (direct agglutination inhibition test) 4. 协同凝集试验（co-agglutination test） 载体为金葡菌，其细胞壁蛋白A与IgG 的Fc结合，用 于细菌、病毒的快速检测。
双向免疫扩散 （Double Immunodiffusion)

是将抗原与抗体分别加入 琼脂凝胶的小孔中，二者 自由向周围扩散并相遇， 在比例合适处形成沉淀线。 如果反应体系中含两种以 上的抗原抗体系统，则小 孔间可出现两条以上的沉 淀线。本法常用于抗原或 抗体的定性 、组成和两 种抗原相关性分析的检测。
免疫荧光法图示
２．酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)
此法将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用
的高效性相定仪测定光密度（OD）值
可反映抗原含量，灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平。
常见的标记物为：辣根过氧化物酶（ HRP ）和碱 性磷酸酶（AP）
沉淀反应
1．单向免疫扩散(single immunodiffusion)
2．双向免疫扩散(double immunodiffusion)
单向免疫扩散 (Single Immunodiffusion)
含抗体的凝胶

沉淀环
是将一定量已知抗体混于 琼脂凝胶中制琼脂板，在 适当位臵打孔后将抗原加 入孔中扩散。抗原在扩散 过程中与凝胶中的抗体相 遇，形成以抗原孔为中心 的沉淀环，环的直径与抗 原含量成正比相关。本法 常用于测定血清IgG、IgM、 IgA 和 C 3等的含量。
性或定位。
免疫荧光法分类
（1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本 进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任
一抗原均须制备相应荧光抗体。
（2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再
用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感
度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可
用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。
3．放射免疫技术
分类： （1）放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA) （2）免疫放射分析法（immunoradiometric assay, IRMA）
放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)
乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学
检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原 抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。常用 于标记的放射性核素为 125I和131I，分为液相和固 相两种方法。
发光免疫技术
金免疫技术
凝集反应（Agglutination Tests）
颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合， 在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集 反应(agglutination) 。
用于凝集反应中的抗原称凝集原(agglutinogen)。 用于凝集反应中的抗体称凝集素（agglutinin)。
反应分两步进行
第一步:反应系统与补体的作用
第二步:指示系统利用剩余补体的反应
不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性
已知抗原加入血清（检测抗体） 加入标准量补体 加入包被抗体的红细胞 检测红细胞溶解情况
Ab
Ag
No Ab
Patient’s serum
Ag
免疫标记技术 （Immunolabelling technique）
前带现象（prozone）和后带现象(postzone)

Ab过剩和Ag过剩
抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象， 与两者的浓度和比例密切相关
前带现象（prozone）和后带现象(postzone)
Ab过剩和Ag过剩
抗体过剩
抗体抗体比例合适
抗原过剩
网格学说（lattice theory）
抗原 抗体
妊娠免疫诊断试验

HCG检测为间接凝集试验的应用 孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增 高。（HCG是可溶性抗原 ） 反之，非孕妇尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗 HCG抗体。