第六章 原生质体融合
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NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再 相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。
2 高pH(10.5)-高Ca离子法
1973年：Keller和Melchers用pH10.5的 50 mMCaCl2溶液在37℃时，诱 发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。
细胞质杂种
细胞质杂种只具有一个亲本的细胞核，而具 有两个亲本细胞质的遗传物质，细胞质杂种可用 来转移细胞质基因所决定的遗传性状，如胞质雄 性不育基因，抗除草剂基因及其对某些抗生素抗 性的特征，以及一些光合作用有关的特征，均可 通过胞质杂种来转移这些优良基因，因而在遗传 育种中具有重要意义。
非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一 亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞 质融合； 细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一 亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同 的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因 组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
原生质体的融合过程包括3个主要阶段：
1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。
①凝聚作用阶段：
两个或两个以上原生 质体膜彼此靠近
②小区域融合阶段：
相互靠近的原生 质体质膜在很小的局 部区域紧密粘连、彼 此融合，两个原生质 体间出现连续状态， 或出现桥。
以下原生质体融合均可发生
例如：
猴和小鼠 牛和大肠杆菌 苹果和番茄 马铃薯和番茄 人和小鼠细胞
二、原生质体融合的类型
1.依据所选用亲本原生质体的来源可分为：
①体细胞杂交：
双亲的体细胞原生质体进行融合
②配子－体细胞杂交：
融合亲本一个是体细胞原生质体，另一个为性 细胞原生质体。精卵细胞与体细胞原生质体融 合可获得三倍体杂种。
两次不同培养条件的培养
第一次培养条件只适合于甲亲本而不适合乙亲本 ，一段时间后，生存下来的是：1)未经融合的甲 亲本；2)甲甲融合的产物；3)有甲亲本基因存在 的甲乙融合产物。 转入第二个培养条件，只适合乙亲本原生质体生 长，甲原生质体死亡。 两次培养之后，能存活下来的只有具甲乙亲本基 因并得到互补的杂种细胞。
（二）机械选择法
荧光染料法 两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧 光的荧光染料进行染色。
细胞分类器辨别和收集发两种荧光的异核体。
但仪器价格昂贵，不常用。
异硫氰酸荧光素（FITC）和 异硫氰酸罗丹明（RITC） 分别发出绿色和红色
二、杂种的鉴定
形态学 细胞学
遗传标记
1、形态学
比较再生植株与融合亲本在形态上的异同 株高、株型、叶片大小、形状、气孔的大 小与多少，花的形状、大小及颜色。
双失活
经过不断的改良，现已普遍采用双失活体系， 即将一个亲本的原生质体经辐射处理使细胞核失活， 来作为细胞质供体，另一个亲本用代谢抑制物碘乙酸 盐类处理，使细胞质暂时失活。诱导此两种亚原生质 体融合，由于生理互补效应，杂种细胞可以生长和持 续分裂。因而双失活处理的供体－受体原生质体融合 系统中，不需要双亲具有选择标志。杂种即可被筛选 出来。
③融合阶段
原生质桥 扩展，融合完 成，形成球形 的异核体或同 核体。
4 电融合法
Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合
电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极， 一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变 电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一 条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电 击穿，从而导致融合。
3 PEG法
PEG：Polyethylene Glycol（聚乙二醇）
1974年：
Kao KN和Michayluk采用此法大大提高融合频率。
1976年：
Kao发现用高pH和高Ca结合融合频率更高。
用高钙强碱溶液代替培养基清洗PEG。
PEG法特点： 融合频率高
可重复性强
诱发融合无特异性 毒性较低
非对称融合：是指利用物理或化学方法使某 亲本的核或细胞质失活再融合。
对称融合
异核体或异核细胞，细胞质融合但细胞核未融 合，同在一个细胞中。
同核体，两个相同原生质体在诱导剂作用下发 生融合，则称为同核体。 合子细胞，完全融合，称为杂种原生质体或合 子细胞。
非对称融合
非对称杂种或细胞质杂种：异核体中的两个 细胞核，若亲缘关系太远，其中一个核的染 色体逐个被排除掉，这种细胞称为非对称杂 种。如果整个核完全消失，细胞质仍为杂合 ，这种融合细胞称为细胞质杂种。
诱发融合
(induced fusion) 物理和化学方法
1.NaNO3 2.高pH-高Ca离子 3.PEG 4.电场融合
1 NaNO3法
1909年：Kuster证实引起亚原生质体融合 1970年：Power报道可重复控制原生质体融合 1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例
杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。
第三节 体细胞杂种选择及鉴定
一、杂种细胞的筛选
二、杂种细胞的鉴定
三、体细胞杂种的遗传特征
四、细胞质工程
一、杂种细胞的筛选
杂种细胞的选择有两种，即根据其遗传和生理特性 的互补选择法和根据可见标记性状的机械选择法。
（一）互补选择法
1. 营养代谢互补选择法 2. 抗性互补选择法 3. 叶绿素缺失突变体互补选择法 4. 两次不同培养条件的培养
第六章 原生质体融合（植物体细胞杂交）
原生质体融合的概念和意义
融合方法
体细胞杂种鉴定方法
第一节 原生质体融合的概念及意义
一、植物原生质体融合的概念： 是指将植物不同种、属甚至科间的原生 质体通过人工调控的方法诱导融合，然后进 行离体培养，使其再生杂种植株的技术。 真正意义上的原生质体融合： 植物～植物，动物，微生物的原生质体均 可诱导融合。
③配子间原生质体融合：
融合亲本为精卵细胞，精卵细胞的体外融合成
功，标志着高等植物受精过程的研究从此可以
置于人工控制的离体条件下进行。
原生质体融合的类型
2.依据所选用亲本原生质体的来源是否相同：
自发融合（仅限同一物种之内）
诱导融合（指应用某种诱变剂导致原 生质体融合的方法）
诱导融合
对称融合：是指两个完整的原生质体融合， 在融合子细胞内含有两个融合亲本全套染色 体和全部的细胞质。
2、细胞学
染色体形态和数目的比较
3、遗传标记
SSR RFLP 同功酶 RAPD AFLP
分析所鉴定植株是否具有融合亲本的遗传物质 再生植株同时具有亲本的带；
再生植株在一种情况下具有一个亲本的带， 在另一种情况下具有另一个亲本的带。
三、体细胞杂种的遗传特征
1.细胞分裂和染色体数目的不稳定性。 2.杂种植株的不育性。
四、细胞质工程
（一）细胞质杂种 （二）细胞器移植 （三）微生物移植 （四）外源DNA移植
二、原生质体融合的意义
1.意义
—克服杂交不亲合
—克服生殖器官败育
—克服柑桔多胚
2、成
就
1972年 Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种。
1975年柑桔原生质体培养成功；
现有苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵 牛等作物的原生质体培养成功； 木本植物中柑桔最为成功。
第二节融合方法
自发融合 (Spontaneous fusion)
电融合仪
电融合法原理
交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿 着电极排列，
+
-
-
+ + -+ -+ -+ - 正极
+ +
+ +
施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质 膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。 + + -
+ + -+ -+ -+ -
+ + -+ -
+ + -+ -+ -+ -
2 高pH(10.5)-高Ca离子法
1973年：Keller和Melchers用pH10.5的 50 mMCaCl2溶液在37℃时，诱 发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。
细胞质杂种
细胞质杂种只具有一个亲本的细胞核，而具 有两个亲本细胞质的遗传物质，细胞质杂种可用 来转移细胞质基因所决定的遗传性状，如胞质雄 性不育基因，抗除草剂基因及其对某些抗生素抗 性的特征，以及一些光合作用有关的特征，均可 通过胞质杂种来转移这些优良基因，因而在遗传 育种中具有重要意义。
非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一 亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞 质融合； 细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一 亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同 的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因 组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
原生质体的融合过程包括3个主要阶段：
1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。
①凝聚作用阶段：
两个或两个以上原生 质体膜彼此靠近
②小区域融合阶段：
相互靠近的原生 质体质膜在很小的局 部区域紧密粘连、彼 此融合，两个原生质 体间出现连续状态， 或出现桥。
以下原生质体融合均可发生
例如：
猴和小鼠 牛和大肠杆菌 苹果和番茄 马铃薯和番茄 人和小鼠细胞
二、原生质体融合的类型
1.依据所选用亲本原生质体的来源可分为：
①体细胞杂交：
双亲的体细胞原生质体进行融合
②配子－体细胞杂交：
融合亲本一个是体细胞原生质体，另一个为性 细胞原生质体。精卵细胞与体细胞原生质体融 合可获得三倍体杂种。
两次不同培养条件的培养
第一次培养条件只适合于甲亲本而不适合乙亲本 ，一段时间后，生存下来的是：1)未经融合的甲 亲本；2)甲甲融合的产物；3)有甲亲本基因存在 的甲乙融合产物。 转入第二个培养条件，只适合乙亲本原生质体生 长，甲原生质体死亡。 两次培养之后，能存活下来的只有具甲乙亲本基 因并得到互补的杂种细胞。
（二）机械选择法
荧光染料法 两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧 光的荧光染料进行染色。
细胞分类器辨别和收集发两种荧光的异核体。
但仪器价格昂贵，不常用。
异硫氰酸荧光素（FITC）和 异硫氰酸罗丹明（RITC） 分别发出绿色和红色
二、杂种的鉴定
形态学 细胞学
遗传标记
1、形态学
比较再生植株与融合亲本在形态上的异同 株高、株型、叶片大小、形状、气孔的大 小与多少，花的形状、大小及颜色。
双失活
经过不断的改良，现已普遍采用双失活体系， 即将一个亲本的原生质体经辐射处理使细胞核失活， 来作为细胞质供体，另一个亲本用代谢抑制物碘乙酸 盐类处理，使细胞质暂时失活。诱导此两种亚原生质 体融合，由于生理互补效应，杂种细胞可以生长和持 续分裂。因而双失活处理的供体－受体原生质体融合 系统中，不需要双亲具有选择标志。杂种即可被筛选 出来。
③融合阶段
原生质桥 扩展，融合完 成，形成球形 的异核体或同 核体。
4 电融合法
Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合
电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极， 一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变 电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一 条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电 击穿，从而导致融合。
3 PEG法
PEG：Polyethylene Glycol（聚乙二醇）
1974年：
Kao KN和Michayluk采用此法大大提高融合频率。
1976年：
Kao发现用高pH和高Ca结合融合频率更高。
用高钙强碱溶液代替培养基清洗PEG。
PEG法特点： 融合频率高
可重复性强
诱发融合无特异性 毒性较低
非对称融合：是指利用物理或化学方法使某 亲本的核或细胞质失活再融合。
对称融合
异核体或异核细胞，细胞质融合但细胞核未融 合，同在一个细胞中。
同核体，两个相同原生质体在诱导剂作用下发 生融合，则称为同核体。 合子细胞，完全融合，称为杂种原生质体或合 子细胞。
非对称融合
非对称杂种或细胞质杂种：异核体中的两个 细胞核，若亲缘关系太远，其中一个核的染 色体逐个被排除掉，这种细胞称为非对称杂 种。如果整个核完全消失，细胞质仍为杂合 ，这种融合细胞称为细胞质杂种。
诱发融合
(induced fusion) 物理和化学方法
1.NaNO3 2.高pH-高Ca离子 3.PEG 4.电场融合
1 NaNO3法
1909年：Kuster证实引起亚原生质体融合 1970年：Power报道可重复控制原生质体融合 1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例
杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。
第三节 体细胞杂种选择及鉴定
一、杂种细胞的筛选
二、杂种细胞的鉴定
三、体细胞杂种的遗传特征
四、细胞质工程
一、杂种细胞的筛选
杂种细胞的选择有两种，即根据其遗传和生理特性 的互补选择法和根据可见标记性状的机械选择法。
（一）互补选择法
1. 营养代谢互补选择法 2. 抗性互补选择法 3. 叶绿素缺失突变体互补选择法 4. 两次不同培养条件的培养
第六章 原生质体融合（植物体细胞杂交）
原生质体融合的概念和意义
融合方法
体细胞杂种鉴定方法
第一节 原生质体融合的概念及意义
一、植物原生质体融合的概念： 是指将植物不同种、属甚至科间的原生 质体通过人工调控的方法诱导融合，然后进 行离体培养，使其再生杂种植株的技术。 真正意义上的原生质体融合： 植物～植物，动物，微生物的原生质体均 可诱导融合。
③配子间原生质体融合：
融合亲本为精卵细胞，精卵细胞的体外融合成
功，标志着高等植物受精过程的研究从此可以
置于人工控制的离体条件下进行。
原生质体融合的类型
2.依据所选用亲本原生质体的来源是否相同：
自发融合（仅限同一物种之内）
诱导融合（指应用某种诱变剂导致原 生质体融合的方法）
诱导融合
对称融合：是指两个完整的原生质体融合， 在融合子细胞内含有两个融合亲本全套染色 体和全部的细胞质。
2、细胞学
染色体形态和数目的比较
3、遗传标记
SSR RFLP 同功酶 RAPD AFLP
分析所鉴定植株是否具有融合亲本的遗传物质 再生植株同时具有亲本的带；
再生植株在一种情况下具有一个亲本的带， 在另一种情况下具有另一个亲本的带。
三、体细胞杂种的遗传特征
1.细胞分裂和染色体数目的不稳定性。 2.杂种植株的不育性。
四、细胞质工程
（一）细胞质杂种 （二）细胞器移植 （三）微生物移植 （四）外源DNA移植
二、原生质体融合的意义
1.意义
—克服杂交不亲合
—克服生殖器官败育
—克服柑桔多胚
2、成
就
1972年 Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种。
1975年柑桔原生质体培养成功；
现有苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵 牛等作物的原生质体培养成功； 木本植物中柑桔最为成功。
第二节融合方法
自发融合 (Spontaneous fusion)
电融合仪
电融合法原理
交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿 着电极排列，
+
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+ + -+ -+ -+ - 正极
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施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质 膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。 + + -
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