CaCl2 转化

氯化钙法进行质粒转化

摘要：利用冰冷的CaCl2 制备competent cells,以传统方法进行质体的转形.

利用冰冷的CaCl2 制备competent cells,以传统方法进行质体的转形.

仪器用具：37℃培养箱；42℃水浴；冰浴

药品试剂：

0.1 M CaCl2置冰浴中

2 M glucose：

取18 g glucose溶于水中,并调体积至50 mL,无菌过滤,分装后置-20℃贮存.

2 M Mg2+：

取20.3 g MgCl2 ·6H2O及24.65 g MgSO4 ·7H2O溶于水中,并调体积至100mL,无菌过滤的,分装小瓶置-20℃贮存.亦可以MgCl2完全取代MgSO4.

SOB 液体培养基：

32 Methods in Biotechnology Vol 1

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,高压灭菌,使用前加入2 M Mg2+,使最终浓度为10 mM.

SOB 固体培养基：

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.5% Bactoagar,高压灭菌,倒plate前加入2 M Mg2+ 使最终浓度为10 mM.

SOC/Amp 固体培养基：

SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin.

SOC 液体培养基：SOB 中加入20 mM glucose （使用前加入）.

大肠杆菌菌株：JM109,#1~#5 接合反应液方法步骤：

1）进行转形实验前16~20 h,自-70℃取出贮存的菌种,以划单一菌落方式将菌株JM109 接种在SOB固体培养基上,在37℃培养.

2）取40 mL SOB培养基装入125 mL已灭过菌的三角瓶（请记得加入Mg2+）. 另取1 mL SOB 加于微量离心管中.由SOB固体培养基上选4~6 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1 mL SOB 中,震荡将菌体打散后,加入40 mL SOB中,于37℃震荡培养约2~3 h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 可于接菌2 h后每隔20~30 min测A600估计

3）收集菌液于离心管中,置冰浴中10~15 min.

4）以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）.

5）倒去上清,并尽量将液体倒干,或以微量移液器头吸干净.

6）沉淀加入1/3 菌液体积冰冷的0.1 M CaCl2,稍加震荡,混合均匀,置冰浴中10~15 min.

7）同上4）, 5）的操作.再重复6）, 4）, 5）的操作,以使反应更完全,增加成功率.

8）加入1/25 菌液体积冰冷的0.1 M CaCl2,稍加震荡使混合均匀.

◆Competent cells 制备完成！

9）DNA 样品（<10 μL）先装于微量离心管中,置冰浴中预冷,另取一微量离心管,标上#0,不加入任何DNA （作为negative control）,亦置冰浴中预冷.

每个样品加入200 μL 菌液,震荡混合后,置冰浴中20~40 min.

10）42℃加热90 s （温度及时间均需很准确,请事先检查水浴锅的温度,不可超过42℃）.

◆Heat shock!

11）置冰浴中2 min.

12）加入800 μL SOC,混合后,于37℃震荡培养30~60 min.

13）将各管转形液上下摇动混合均匀后.#5 取20 μL 至另一离心管中,加入180μL SOC （稀

释10 倍）,混合均匀后,涂布于SOC/Amp plate. #0, #1~#4 各取200 μL 涂抹在SOC/Amp plate. 剩余菌液以6,000 rpm 离心1 min,倒去上清,沉淀加入200 μL SOC,均匀打散后涂抹在另一个SOC/Amp plate 上.

14）待培养基表面的菌液完全被吸收后,倒置培养皿于37℃培养16~20 h 后,观察各个plate 上菌落的形状并计算菌落数.