活体电穿孔法介绍
(优选)电穿孔简介详解.
采用电穿孔的优点
• 本质上属于物理的方法，不采用任何化学试剂， 因此不会对细胞产生损伤
• 操作方便 • 低毒性 • 高的转染效率 • 使用于种类广泛的细胞
电穿孔的主要应用
• 导入标记基因，起到标记、指示的作用
• 导入具体的功能基因进行研究
• 导入药物、蛋白、抗体等其他分子对细胞的结构 和功能进行研究
• 如果样品量很少的话，那么产生的热量会使 得样品蒸发
• 如果由于样品的低电阻而产生电弧，那么 GPX会给出提示，并不能提供脉冲
特点: 模块化设计
系统部件
PC模块 CE模块
主机 ShockPod电击槽
特点: 友好的操作界面
• 图表化的操作界面可以设置所有的实验参数，包括附属模块的参数
特点: 可选择的程序设置
• 脉冲的间隔时间就是指2个脉冲 间的时间
• 脉冲下降是指终止电压和起始 电压值之间的差值
GPX和方波
高电压回路: 一次充电，一次脉冲。在下一次脉冲前，电容器 需要重新充电 最多只能进行2次脉冲，脉冲时间为0.05 – 5msec ，脉冲间隔为5-30sec
低电压回路: 该电路是可调的，因此可一次充电，进行多次的 脉冲 最多可进行10次脉冲，脉冲时间为0.05-100msec ，脉冲间隔为 0.1 – 10 sec
括附属模块的参数 • 提供多种操作模式，包括手动设置、预设模式、用户编
程等多种方式
主要的优点、特点：2种波型
电穿孔的过程中可以有2种波型来控制外界电压的变化
The Gene Pulser Xcell可以提供2种波型，即指数波和方 波
Exponential Decay
• 电容器充电到预定的电压(v0)放电后， 即向样品释放脉冲，细胞表面的电压 随时间按指数方式下降的
质粒导入动物细胞的方法
质粒导入动物细胞的方法导言动物细胞内的质粒导入是生命科学中一项重要的技术，用于研究基因功能、制备重组蛋白以及疾病治疗等方面。
质粒导入方法主要包括物理法、化学法和生物法。
在本文中，我将详细介绍这些方法以及它们的优缺点，以帮助读者了解质粒导入动物细胞的原理和应用。
一、物理法1. 电穿孔法电穿孔法是通过电压脉冲将质粒导入细胞。
高电场脉冲会导致细胞膜上形成暂时的孔道，使得质粒能够进入细胞内。
该方法适用于许多细胞类型，包括植物细胞和动物细胞。
然而，电穿孔法对细胞有一定的损伤，并且操作复杂，需要特殊的电穿孔设备。
2. 微弹珠法微弹珠法是将质粒与微弹珠共同添加到含有细胞的培养基中，然后通过一定压力的激光束或气压将微弹珠推入细胞内，从而实现质粒的导入。
这种方法简单易行，可以同时导入多个质粒，但对细胞的损伤较大。
3. 基因枪法基因枪法是将质粒与金粒等物质共同添加到基因枪的炮弹中，然后利用气压或爆炸将炮弹射入细胞中。
这种方法适用于质粒导入动物细胞以及其他非细胞的样本。
基因枪法操作相对简单，但对细胞的损伤较大。
二、化学法1. 钙磷共沉法钙磷共沉法是将质粒与钙盐和磷酸盐等化合物共同添加到细胞培养基中，形成复合物后从而导入细胞内。
这种方法适用于质粒导入动物细胞，操作相对简单，但效率较低。
2. 脂质体转染法脂质体转染法是将质粒与合适的脂质体混合后，形成质粒-脂质体复合物，并与细胞膜发生相互作用，从而实现质粒的导入。
这种方法适用于许多细胞类型，操作简单，但效率有限。
3. 聚合物转染法聚合物转染法是将质粒与聚合物复合后，与细胞膜发生相互作用，实现质粒的导入。
这种方法适用于许多细胞类型，操作简单，但由于聚合物体积大，导致质粒的导入效率较低。
三、生物法1. 病毒介导的转导病毒介导的转导是利用病毒载体将质粒导入细胞，并使质粒在细胞内复制和表达。
这种方法适用于许多细胞类型，操作简单，但需要特殊的实验环境和设备，且存在一定的安全隐患。
2. 瞬时共转染法瞬时共转染法是利用适当的方法同时将质粒和辅助质粒导入细胞中，使细胞在短时间内同时表达两者。
电穿孔法转染细胞原理
电穿孔法转染细胞原理
电穿孔法转染细胞是一种常用的基因转染技术，它利用高压电脉冲破坏细胞膜，使外源DNA进入细胞内。
其原理如下：
1. 电场诱导细胞膜孔洞形成
电穿孔法转染细胞的第一步是利用高压电脉冲产生强电场，电场的作用下，细胞膜内部的离子和分子会发生移动，形成孔洞。
这些孔洞的大小和数量取决于电场的强度和持续时间。
2. DNA进入细胞内
一旦细胞膜形成了孔洞，外源DNA便可以通过孔洞进入细胞内。
这些DNA分子可以是裸露的质粒DNA，也可以是DNA与载体复合物。
3. 细胞修复孔洞
在电穿孔的过程中，细胞膜受到了破坏，但细胞会尽快修复这些孔洞。
细胞膜修复的过程中，外源DNA可能会被稳定地整合到细胞基因组中，从而实现基因转染。
总的来说，电穿孔法转染细胞利用高压电脉冲破坏细胞膜，使外源DNA进入细胞内，然后通过细胞修复孔洞的过程，使外源DNA整合到细胞基因组中。
这种技术可以用于基因敲除、基因表达、基因编辑等多种研究应用。
电穿孔简介
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目录
• 电穿孔技术概述 • 电穿孔技术原理 • 电穿孔技术实验及数据分析 • 电穿孔技术优缺点及改进方案 • 电穿孔技术前景展望及未来发展趋势
01
CATALOGUE
电穿孔技术概述
技术定义
电穿孔技术是一种基于电场作用，在细胞膜上 形成瞬时孔道，从而改变细胞膜通透性，实现 物质跨膜转运和细胞融合的技术。
03
近年来，电穿孔技术的研究更 加深入，应用领域也更加广泛 。
技术应用领域
基因导入
电穿孔技术可将外源基因导入细胞内 ，为基因治疗和基因疫苗制备提供有 效手段。
药物输送
通过电穿孔技术，可将药物准确送达 靶细胞，提高药物治疗效果和降低副 作用。
疫苗制备
电穿孔技术可用于制备亚单位疫苗和 基因工程疫苗，提高疫苗的安全性和 有效性。
• 电穿孔（Electroporation）是一种基于电场诱导的细胞 膜可逆性穿孔技术，通过施加高强度电场，使细胞膜产生 可逆性穿孔，从而实现细胞膜的通透性改变、细胞内外的 物质交换以及细胞融合等生物效应。
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它利用高强度电场脉冲在细胞膜上诱导产生可 逆性孔道，允许原本不能透过细胞膜的物质进 入细胞内。
电穿孔技术可用于基因导入、药物输送、疫苗 制备等领域，具有高效、安全、可控等优点。
技术发展历程
01
电穿孔技术的发展经历了数十 年的研究历程，最早可追溯到 20世纪70年代。
02
早期的研究主要集中在实验室 内的基础研究，随着技术的不 断发展和完善，逐渐应用于临 床研究和实际应用。
04
CATALOGUE
电穿孔技术优缺点及改进方案
电穿孔技术优缺点及改进方案
电穿孔技术辅助眼内基因治疗
着人类基因组研究计 划 的成 功 ， 因图及基 因序列 的完 成 ， 基 目
前在基因水平认识 疾病 的发 生 、 发展 。基 因治疗从病 因学方 面
防治疾病 ， 具有广 阔 的临床前 景。其关键 技术 是基 因转 移 ， 包
括治疗基因的选 择 、 基因导 入 系统 的选择 、 疗基 因 的高 效靶 治 向表 达及对此表 达 的调控。而导人 系统 是基 因治疗 的核 心技
术， 是基因治疗能够进入 临床 的关键之一 。外 源基 因 的导 人可
以通过物理 、 化学或生 物学方法 来实现 。电穿孔 方法是物 理导
电穿孔特性受到多种 因素 的影响 ， 电压 、 如 电穿 孔次数 和
时问 、 温度 、 Ｎ Ｄ Ａ的状 态和浓度等 ， 数设 定不佳将 对组 织产生 参
一
因转染在眼 内疾病治疗 中的研究进展做一综述 。 眼内许多疾病 的发 生都是 以基 因表达 失调 为特征 的。随 没有末端的重排 和修饰 ， 这对于外源基 因高效 表达 以及保证 其 安全性 非常重要 。 电穿 孔 能 大 大 增 强 Ｄ Ａ 注射 后 的基 因 导 入 作 用 。如 Ｎ Ｂａ —ａｋ 等 观察到 ， ｌｉＰ ｒｓ ｒ 电穿孔法与单用裸质粒 Ｄ Ａ直接 注射 Ｎ 法相 比 ， 在对 鼠角膜细 胞基 因导入效 果上 ， 前者 的转基 因产物
Ｄ Ａ较易接触到的质地较坚韧的组 织 ， Ｎ 如皮肤 ， 而视网膜 、 胚胎 等会由于机械刺激和 出血造成器质性损 伤或发育停 滞 ， 并且 表 达效 率较低 。电穿孔 法的基 因导入 和表达 效率 明显 高于其 他
方法 ， 而且适合 多种 组织 的操 作 。但 电 穿孔法 也 存 在一 定 缺
5 电穿孔方法向活体动物导入外源基因
实验五、电穿孔方法向活体动物导入外源基因1 材料与方法1.1 材料实验室购买的金鱼、真核表达质粒pCMV/β-gal。
实验在北京市北京科技大学理化楼120进行。
1.2 试剂鱼安定溶液、PBS溶液、固定液、洗液1、洗液2、染液。
1.3 方法1.3.1 电穿孔法转染质粒（第一天）称取100mg鱼安定溶于200ml水中，制成麻醉液。
将鱼放入麻醉液中麻醉，待鱼运动缓慢且无规则时取出。
用PBS清洗微量注射器针头，再用微量注射器将10μl质粒溶液打入鱼头部中间隆起的组织中，立即将电击器在注入质粒pCMV/β-gal处贴鱼电击（两电极间应不产生电火花）几次。
将电击后的金鱼放回清水中，待鱼清醒后，更换一次清水，培养一天（水中用供氧器提供氧气）。
1.3.2 转染细胞染色（第二天）将鱼去头处死，取少量电击部位的组织（样品）和其余未注射质粒的组织（空白对照）分别剪碎置于离心管中，小心滴加1ml固定液，室温静置10-15min，然后吸除固定液，加入1ml洗液1，轻轻晃动，室温静置5min，然后吸除洗液1，再加入1ml洗液1，50℃水浴1小时，水浴期间不得离人；吸出洗液1，再加入1ml洗液2，轻轻晃动，室温静置5min，然后吸除洗液2。
加入1ml染液，37℃培养箱中静置24h。
1.3.2 观察（第三天）压片、用光学显微镜观察细胞颜色、拍照（要注明放大倍数，以目镜×物镜倍数表示，如10×40）。
2 结果与讨论附录药品的配置表名称配制方法PBS缓冲液NaCl 8.00g，Na2HP04 1.15g，KCl 0.20g，KH2P04 0.20g，pH调至7.2，超纯水定容到1000mL，分装，121 ℃灭菌20 min。
0.1 M铁氰化钾储液 1.646g铁氰化钾加入50mlPBS溶液，121 ℃灭菌20 min。
0.1 M亚铁氰化钾储液 2.112g亚铁氰化加入50mlPBS溶液，121 ℃灭菌20 min。
电穿孔法步骤
电穿孔法步骤
电穿孔法呀，这可是个挺有意思的技术呢！咱就来说说它的那些步骤吧。
你看啊，就像我们要做一道特别的菜一样。
首先得把需要处理的细胞啥的准备好呀，这就好比准备做菜的食材，得新鲜、得合适。
然后呢，把这些细胞放在一个特定的容器里，就像把食材放在锅里一样。
接下来，就是关键的一步啦！要给这个容器加上电场，这电场就像是给细胞来一场特别的“洗礼”。
哎呀，你想想，这细胞在电场里，是不是有点像在风雨中接受洗礼的小花朵呀！它们会在这个电场的作用下，发生一些奇妙的变化呢。
这时候可不能马虎呀，得把握好电场的强度和时间，太强了不行，太弱了也没效果，时间长了不行，短了也不行。
这就跟做饭火候似的，得恰到好处。
等电场作用完了，这些细胞就好像经历了一场特别的冒险。
然后呢，我们就可以观察它们的变化啦，看看是不是达到了我们想要的效果。
你说这电穿孔法是不是很神奇呀？就这么几个步骤，却能让细胞发生那么大的变化。
这就像是变魔术一样，只不过这个魔术是为了科学，为了帮助我们更好地了解和利用细胞。
其实呀，做任何事情不都像电穿孔法一样嘛，都需要认真对待每一个步骤，不能有丝毫的马虎。
就像盖房子，得一块砖一块砖地垒起来，少了哪一块都不行。
电穿孔法也是这样，每一个环节都很重要，都得精心呵护。
所以呀，我们在做实验的时候，可一定要细心细心再细心，不能有一点差错。
这可关系到我们的研究成果呀，关系到我们能不能取得好的结果。
总之呢，电穿孔法就是这么神奇又有趣，只要我们认真对待，就一定能让它发挥出最大的作用！。
活体电穿孔法(in vivo electroporation) 介绍-1
活体电穿孔法(in vivo electroporation) 介绍-11、什么是活体电穿孔活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。
由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用，并且效率较高。
活体电穿孔法的原理很简单，在直流电场作用的瞬间，细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道1 05～115μm ，这种通道能维持几毫秒到几秒，然后自行恢复。
在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。
近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多，在基因治疗方面的优势也日趋显著，是一种很好的活体基因导入方法。
活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。
大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。
因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多。
2、活体电穿孔的法的特点活体电穿孔法基因导入和表达效率较高，它的特点主要在以下几个方面:首先，靶器官的选择面广，理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官。
在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。
如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中，则在某种意义上说已失去了基因导入的价值，这在基因治疗中是关键性的问题。
当使用组织特异性表达载体时，研究人员应根据所构建的表达载体来选择基因转移和表达的靶器官组织。
例如鱼精蛋白21 启动子可指导外源基因在精母细胞中特异性表达，以小鼠的睾丸作为靶器官将含有鱼精蛋白21启动子的表达载体导入，获得外源基因的表达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达。
其次，对导入的外源基因片段的大小没有限制，从几KB 或十几KB 的表达载体，到100～200KB 的YAC、BAC基因组，都有成功导入并获得表达的报道。
此外活体电穿孔法操作简单快速，电穿孔的时间只有几秒钟，而且DNA 片段不需要特殊的纯化操作。
细胞融合技术—电穿孔和电融合技术
细胞融合技术—电穿孔和电融合技术
电穿孔技术
教材研究：细胞融合技术有多种，如灭活的病毒、聚⼄⼆醇、电刺激等，那么，物理⽅法中的电刺激技术是怎么样的呢？
⼀、电穿孔技术
当细胞置于⾮常⾼的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分⼦扩散进细胞内，这⼀现象称为电穿孔。
运⽤这⼀技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋⽩质、药物、抗体和荧光探针都能载⼊细胞。
作为⼀种基因转导⽅法，电穿孔已被⼴泛⽤于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；⽽且，它还能作为注射⽅法（称为电注射），把各种外源物质引⼊活细胞。
与其他常⽤的导⼊外源物质的⽅法相⽐，电穿孔具有很多优点。
⾸先，不必象显微注射那样使⽤玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以⼀次对成百万的细胞进⾏注射。
第⼆，与⽤化学物质相⽐，电穿孔⼏乎没有⽣物或化学副作⽤。
第三，因为电穿孔是⼀种物理⽅法，较少依赖细胞类型，因⽽应⽤⼴泛。
实际上，对⼤多数细胞类型，⽤电穿孔法基因的转移效率⽐化学⽅法⾼得多。
⼆、电融合技术
除了能使细胞膜具有通透性，让外界的分⼦扩散⼊胞液中以外，⾼强度的电场脉冲也能引起细胞融合，这⼀现象叫做电融合。
然⽽，在⽤电脉冲融合前必须使细胞相互紧密接触，这⼀电融合⽅法在原⽣质融合制取杂交植物，胚胎细胞相互融合制备动物克隆⽅⾯⾮常有⽤，尤其在制取杂交瘤细胞制备单克隆抗体⽅⾯⽤处很⼤。
⼏个实验室已证明使⽤电场电融合效率⽐常规的化学融合⽅法⾼10到100倍，最近，贴壁细胞的电融合还被⽤来研究细胞融合时细胞的⾻架成分和细胞器的动⼒学重排。
电穿孔简介课件ppt
注意： PulseTrac 回路技术是Bio-Rad公司的专利技术 ，其他任何厂家都不能提供
PC模块的结构与原理?
• 电流会经过电阻最小的通路
• PC模块中的电阻决定了脉冲过程中的时间常数，电阻越小，放电 时间越短
3ohm 电阻r
电穿孔简介
电穿孔简介
电穿孔的工作原理是什么?
• 电穿孔的基本原理是将细胞置于一个瞬时的高电 场的环境中，此高电场的环境使得细胞膜的表面 出现很多小孔，这种条件下细胞膜对于环境中分 子的透性大大增加，这样就可以将外源分子进入 细胞。
• 利用上述的原理，那么采用电穿孔的方法就可将 DNA等其他类的生物分子导入细胞内部进行研究 ，如蛋白分子、糖类分子等等。
10. User preferences
1. 指数波
程序显示
结果显示
2. 时间常数确定的指数波形 式
程序显示
结果
3. 方波
将CE模块中的低压电容器的精度从20%提高到10% 按下操作面板上的小数点按键
最电多击只 杯能被进加程行上序电2次压显脉后示冲，，细脉胞冲膜时进间行为重0排. ，细胞表面出现很多小孔
• 提供多种操作模式，包括手动设置、预设模式、用户编
程等多种方式
主要的优点、特点：2种波型
电穿孔的过程中可以有2种波型来控制外界电压的变化
The Gene Pulser Xcell可以提供2种波型，即指数波和方 波
Exponential Decay
• 电容器充电到预定的电压(v0)放电后， 即向样品释放脉冲，细胞表面的电压 随时间按指数方式下降的
采用电穿孔的优点
• 本质上属于物理的方法，不采用任何化学试剂， 因此不会对细胞产生损伤
electroporation method
Electroporation(电穿孔)方法一、概述电穿孔是一种生物学实验中常用的方法，它通过利用电场使细胞膜通透性增加，从而促进外部物质的进入或出去。
本文将从电穿孔的基本原理、应用领域、实验操作以及优缺点等方面展开讨论。
二、基本原理电穿孔是利用外加电场对生物体细胞膜造成的电压诱导其通透性增加，使其能够对高分子物质进行暂时性的内吞和外排的一种方法。
在电场的作用下，细胞膜受到电场的影响，出现孔道和通道，从而实现对细胞内外物质的交换。
三、应用领域1. 基因转染电穿孔方法可用于细胞内外质粒DNA、mRNA、siRNA、蛋白质等分子的转染，是目前广泛应用的基因转染方法之一。
2. 药物递送将药物通过电穿孔方法直接导入细胞内，可以提高药物的作用效果，减少药物使用量，降低药物对身体的毒副作用。
3. 细胞治疗在癌症等细胞治疗领域，电穿孔方法可用来引导抗癌药物或免疫治疗剂直接进入肿瘤细胞内，以增强治疗效果。
四、实验操作1. 细胞准备将需要进行电穿孔处理的细胞培养在培养皿中，保持其在对数生长期。
2. 电穿孔处理将细胞用PBS等缓冲液洗涤后，加入待处理的蛋白质、DNA或药物溶液，然后放入电穿孔仪器中进行处理。
3. 细胞培养将处理过的细胞重新培养在含有适当培养基的培养皿中，保持其在恒温箱内培养一段时间。
五、优缺点1. 优点（1）转染效率高：电穿孔处理后，细胞通透性增加，使得外源DNA、药物等分子能够较高效率地进入细胞内。
（2）处理快速：电穿孔处理的时间较短，一般在几十毫秒至几秒之间。
2. 缺点（1）细胞毒性：处理过程中会对细胞产生一定的损伤，影响细胞的生长和代谢。
（2）使用限制：由于电穿孔方法对细胞有一定的毒性和损伤，因此不能应用于一些对处理条件敏感的细胞系。
六、结论电穿孔方法作为一种重要的基因转染和药物递送方法，在生物学研究和临床治疗中得到广泛应用。
然而，其存在的缺点和不足也需要我们更加深入的研究和改进，以促进其在相关领域的更广泛应用。
活体电穿孔法介绍
活体电穿孔法介绍活体电穿孔法（in vivo electroporation）是一种利用电场作用实现基因传递的技术方法。
它通过向生物体的细胞施加较高电场脉冲，使细胞膜发生破坏和通透性增加，从而使外源基因能够进入细胞内。
活体电穿孔法广泛应用于基因治疗、基因转导、细胞修复等领域，在生物医学研究和临床实践中具有重要的应用价值。
活体电穿孔法的基本原理是利用电场作用来改变细胞膜的通透性。
在传统的基因转导方法中，如病毒载体介导的转染，局限性较大，容易受到免疫反应和基因表达的不稳定性等问题。
而活体电穿孔法则可以针对不同细胞类型和组织进行精确控制，实现高效、可重复的外源基因转导。
电场脉冲的产生是活体电穿孔法的前提条件。
通常使用电脉冲发生器来产生足够高的电场脉冲。
电参数的选择是关键，包括脉冲的电压、持续时间、频率等。
这些参数的选择需要根据细胞类型、组织状态以及具体实验目的来确定。
电穿孔过程是指电场作用下，细胞膜发生通透性增加和破坏的过程。
电场脉冲会导致细胞膜上的孔洞形成，从而使外源基因能够进入细胞内。
这个过程主要涉及细胞膜的电极化和去电极化。
电极化是指细胞膜在电场作用下的电位变化，去电极化则是指细胞膜恢复到正常状态的过程。
基因传递与表达是活体电穿孔法的最终目的。
一旦细胞膜被电穿孔，外源基因就有机会进入细胞内，并在细胞内进行表达。
通常在电穿孔后立即给予外源基因的加入。
外源基因可以是DNA、RNA等，具体选择要根据研究需要来确定。
通过活体电穿孔法传递的基因可以实现细胞的基因修复、基因敲除、基因转录调控等。
活体电穿孔法的应用范围十分广泛。
在基因治疗方面，活体电穿孔法可以用于将修复基因传递到患者体内，治疗一些遗传性疾病。
在基因转导方面，活体电穿孔法可以用于将外源基因转导到特定细胞或组织中，实现特定功能的表达。
在细胞修复方面，活体电穿孔法可以用于修复受损细胞的基因，促进组织再生与修复。
总结来说，活体电穿孔法是一种基于电场作用的基因传递技术。
电穿孔技术原理及其在基础医学研究中的应用
电穿孔技术原理及其在基础医学研究中的应用作者：周骏贵来源：《商品与质量·学术观察》2014年第03期摘要：电穿孔技术是在瞬时高电压下DNA等小分子物质得以穿过细胞的技术。
近年来，电穿孔技术已经被广泛应用在体内和体外的各项基础医学和临床实验之中，在保持细胞高存活率的前提下，可以大大提高外源物质进入细胞的效率，并促进目标DNA表达，发挥治疗作用。
本文对电穿孔技术的原理、注意事项及应用进行综述，以期为相关研究提供资料支持。
关键词：电穿孔细胞科研基础医学基因治疗一、电穿孔技术的原理电穿孔（electroporation）是指在高强度、短时间的电压作用之下，外源性物质克服细胞膜的阻碍而进入细胞。
电压的强度超过了细胞膜所能承受的阈值，使膜出现瞬时可逆性的结构变化，从而介导了外源性物质的进入。
这个瞬时的可渗透状态不仅导致小分子物质可通过简单扩散大量进入细胞，而且很多大分子物质如染料分子、DNA分子等也可通过电击的介导进入到细胞内部。
过去电穿孔技术的应用往往受制于电击对细胞造成的伤害难以控制，但近十多年来，随着仪器设备的发展和对实验条件的摸索，电穿孔技术已经被广泛应用在体内和体外的各项实验之中，在保持细胞高存活率的前提下，电穿孔可以大大提高外源物质进入细胞的效率。
使细胞膜达到可渗透状态所需要的场强可用以下的公式来表示：ΔVm=fEextrcosФ其中 f为细胞对电压的耐受常数，Eext为外界电压的强度，r为细胞的半径，cosФ为细胞所处位置与电场方向夹角的余弦值。
一般认为，由于细胞膜所带负电荷的存在，可渗透状态的产生率先发生在细胞面向外界电场正极的一侧，细胞膜的脂质双分子层出现瞬时的亲水性的小孔而允许外源物质的进入。
接着细胞面向电场负极的一侧也出现类似的结构，整个细胞进入可渗状态。
在外界电压达到阈值的前提下，控制电击脉冲的时间和次数可控制细胞进入可渗透状态的程度。
脉冲时间的延长和次数的增多可使得细胞膜面向电场正极的一侧可渗透面积加大，同时使细胞膜面向电场负极的一侧可渗透程度加深。
电穿孔简介
GPX和指数波
• GPX产生指数波的电路结构
基本电路
3ohm 电阻 Charger
电容器
电击杯
充电回路
放电回路
GPX和指数波
• GPX产生指数波的电路结构
充电
3ohm 电阻r Charger
电容器
电击杯
充电回路
放电回路
根据具体电压及电容的选择，可以采用主单元或者CE模块对电容进行充电
GPX和指数波
Ions collect above sample
特点: 模块化设计
系统部件
PC模块
CE模块
主机 ShockPod电击槽
特点: 友好的操作界面
• 图表化的操作界面可以设置所有的实验参数，包括附属模块的参数
特点: 可选择的程序设置
主菜单
HOME 1. 2. 3. 4. 5. Exponential protocol Time constant protocol Square wave protocol Pre-set protocols User protocols
附属模块的参数
• 提供多种操作模式，包括手动设置、预设模式、用户编程 等多种方式
主要的优点、特点：2种波型
电穿孔的过程中可以有2种波型来控制外界电压的变化
The Gene Pulser Xcell可以提供2种波型，即指数波和方波
Exponential Decay
• 电容器充电到预定的电压(v0)放电后， 即向样品释放脉冲，细胞表面的电压随 时间按指数方式下降的 • 电容器的电压值达到峰值释放脉冲后迅 速的衰减 • 电场强度 E (V/cm) 是用来描述电击杯外 界电场环境的一个参数（E=V/d） • 脉冲时间是一般用时间常数来进行衡量 (~37% of V0， V0/e) • 脉冲的时间是由电阻和电容的大小所决 定的
蜜蜂活体电穿孔法导入DNA的新技术
研究真社会昆虫个体特征分化最典型的模式体系， 蜜蜂已成为系统论 、 行为生态学、 神经学和老年化研
究 的模型 】 。蜜蜂 具有世代 周期短 、 繁殖率 高 、 后代
个体数多 、 能大量饲养 、 易获得大量性状一致 、 发育 同步的群体等优点 ， 是理想的实验动物研究模型。 蜜蜂作 为人类 开发利用 最早 和最 成功 的少数 昆
的分子基础 ， 对于理解基因与行 为之间的关 系非常 重 要 因此 转 基 因蜜 蜂 的研究 具 有重 大 的理 论意 。
义 与经济效 益 。
道不断增多， 成为基因治疗 、 生物学分析等领域非常
受欢 迎 的一 种技术 。 不过 ， 电穿孔研 究报道 的昆虫种 类不 是很 多 ： 果蝇 胚胎 、 实夜 蛾 胚胎 以及 家蚕 等 。 谷 家蚕 电穿 孔研 究 报 告 稍 多 ， ｏ Ｍｔ ｏ等 用 电穿 孔方 利 法 成 功地 将家 蚕 丝 素启 动 子驱 动 的 Ｇ Ｐ质 粒导 人 Ｆ 家蚕 幼虫脑 细胞 ， 荧光显微 镜检测 ， Ｆ 经 Ｇ Ｐ得到组织 特异 性表 达 。赵昀等 １ ７ １ 带有 Ｇ Ｐ基 因 的质粒导 在将 Ｆ 人家 蚕卯时 也尝试采 用 电穿 孔法 ， 卵孵化 结茧后 。 蚕
工程 带来 了极 大 的 闻难 ， 尚需通 过 大量研 究 找 到一 种 对蜜蜂 转基 因的有效 模式 ， 而使 外 源基 因能 有 从 效 地转入 、 合并 获得 高效 表达 的新 品种 。 国内外 整
科研人员在转基因蜜蜂的研究上进行 了许多尝试 ， 并开 发 多种 蜜蜂 Ｄ Ａ导人方 法 。如精 子载体 法 、 Ｎ
１ 电穿孔 法原理 与特点
了利用活体电穿孔法将外源 Ｄ Ａ导人成年工蜂头 Ｎ
活体电穿孔法辅助HFA基因免疫小鼠制备单克隆抗体
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活体 电穿 孔法 辅助 Ｈ Ａ 基 因免 疫小 鼠 制备 单克 隆抗体 Ｆ
栾好 飞 一，高 新 ，卞 丽红 付 洁 ， ，邱伟 成 ，董立厚 ，范礼 斌 ，宋海峰 （安徽医科大学基础医学院，
安徽 合肥 ２０ ３ ； ３０ ２ 军事医学科学 院放射与辐射医学研究所 ， 北京 １０ ５ ； ０８ ０ 军事医学科学 院附属 医院妇科 ， 北京 １０７ ） ０ ０ １
测 序 由上 海生 工 完 成 。
细胞电转方法
细胞电转⽅法⼀、引⾔细胞电转，⼜称电穿孔法或电融合法，是⼀种将外源物质导⼊细胞内的技术。
⾃20世纪70年代以来，随着⽣物技术的⻜速发展，细胞电转技术在⽣物学、医学及⽣物⼯程等领域得到了⼴泛应⽤。
本⽂将详细介绍细胞电转的原理、步骤、影响因素、常⻅问题及其解决⽅法，以及细胞电转在各个领域的应⽤。
⼆、细胞电转原理细胞电转的原理是利⽤短暂的⾼强度电场在细胞膜上形成临时性孔洞，从⽽使外源物质如DNA、RNA、蛋⽩质等通过孔洞进⼊细胞内。
当电场消失后，这些孔洞会⾃动修复，⽽进⼊细胞内的外源物质则可以在细胞内发挥作⽤。
三、细胞电转步骤1.细胞准备：选择适当的细胞类型，如贴壁细胞或悬浮细胞，进⾏传代培养。
在电转前，需要将细胞进⾏洗涤，去除培养基中的⾎清和抗⽣素等成分，以减少电转过程中可能的⼲扰。
2.外源物质准备：根据实验需求，制备适量的外源物质，如质粒DNA、mRNA等。
3.电转液配制：选择适当的电转液，如PBS、Opti-MEM等，按照⼀定⽐例稀释外源物质。
4.细胞与电转液混合：将细胞与电转液混合，确保细胞充分悬浮在电转液中。
5.电转操作：将细胞与电转液混合物转移⾄电转杯中，选择合适的电转参数（如电压、电容、电阻等）进⾏电转。
6.电转后处理：电转结束后，将细胞转移⾄新鲜培养基中，进⾏培养。
根据实验需求，可以在不同时间点对细胞进⾏观察和检测。
四、影响细胞电转效率的因素1.细胞类型：不同细胞类型对电转的敏感性不同，因此需要根据实验需求选择合适的细胞类型。
2.电转参数：电转电压、电容、电阻等参数对电转效率有重要影响。
需要根据细胞类型和外源物质的性质进⾏优化。
3.电转液成分：电转液的成分和浓度对电转效率也有⼀定影响。
需要选择合适的电转液，并根据实验需求进⾏调整。
4.温度：电转过程中的温度也会影响细胞电转效率。
通常需要在室温下进⾏电转操作。
五、常⻅问题及其解决⽅法1.细胞死亡率过⾼：可能是由于电转参数设置不当或电转液成分不合适导致的。
电穿孔 分子动力学
电穿孔分子动力学随着科技的飞速发展，电穿孔技术已经成为一种非常重要的分子操作方法，其作用是通过瞬间高压脉冲将细胞膜产生破损，就可以将外来基因或其他物质转移到细胞内。
这种技术已经深入到生命科学、医学、食品科学、农业、工程以及能源科学等领域。
这篇文章主要介绍电穿孔技术及其在分子动力学中的应用。
电穿孔技术的基本原理电穿孔技术是利用强脉冲电场的作用将细胞膜产生破损，使外来物质穿透细胞膜而进入细胞内，并不破坏细胞或细胞器的完整性。
这种技术优点是具有高效性、灵活性、简单易用、对样品不会造成永久性影响等等，因此现在已经广泛地运用于基因转染、药物输送、细胞操纵、细胞融合等领域。
电穿孔技术是相当实用的，它包括了压电式、脉冲式、连续式等类型，是一种非常有效的方法来完成细胞的转染。
其中脉冲式电穿孔技术比较常见。
脉冲式电穿孔技术是利用孔径溶质通过植入细胞膜的电解质微孔，并通过这些孔实现跟细胞内外部体腔的质量转移，最后将质量浓度凝罡升高来完成化学反应。
为了了解更多关于电穿孔技术在分子动力学中的应用，我们可以看到在软物质系统的研究上，电穿孔技术浮出了水面。
传统方法的宏观力学模型难以处理复杂的物理量，而分子动力学模拟可以提供非常高的准确度来处理这么一切。
利用电穿孔技术将其应用于分子动力学模拟中，可以使研究者探究细胞膜破裂的物理机制。
在分子动力学模拟中，电穿孔技术主要分为压电式和脉冲式两类。
压电式电穿孔技术是通过物理力学压实样品，将外来物质瞬间压入细胞膜内部。
而脉冲式电穿孔技术是利用短时间,强脉冲电场对细胞膜进行瞬间损伤，从而实现外来物质进入细胞。
两种方法均可以实现细胞内物质催化反应，同时提高生产效率，降低消耗成本等好处。
虽然电穿孔技术已经在分子动力学模拟中得到了广泛应用，但该技术仍然存在着一些问题，因此还需要继续进行技术和研究上的深入。
例如，电穿孔技术对样品的要求较高，需要充分控制好样品的水分含量、浓度、粘度、pH值等参数才能达到较好的效果。
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活体电穿孔法介绍1、什么是活体电穿孔活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。
由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。
活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。
在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。
近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日趋显著,是一种很好的活体基因导入方法。
活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。
大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。
因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多。
2、活体电穿孔的法的特点活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面:首先,靶器官的选择面广,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官。
在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。
如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题。
当使用组织特异性表达载体时,研究人员应根据所构建的表达载体来选择基因转移和表达的靶器官组织。
例如鱼精蛋白21 启动子可指导外源基因在精母细胞中特异性表达,以小鼠的睾丸作为靶器官将含有鱼精蛋白21启动子的表达载体导入,获得外源基因的表达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达。
其次,对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几KB 或十几KB 的表达载体, 到100～200KB 的YAC、BAC 基因组,都有成功导入并获得表达的报道。
此外活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。
但电穿孔法也存在一些的缺点:首先,外源基因表达持续的时间很短,虽然外源基因导入后最快可在215 小时有表达,但大多1～2 月后表达量降至很低。
外源基因表达的时间主要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大差异。
由于应用不同的表达载体,Muramatsu 在小鼠肝脏进行电穿孔7天后则检测不到外源基因的表达,而Heller 21 天后还可以检测到外源基因的表达。
如果选择代谢和酶活动旺盛的组织器官如肝脏,则表达持续时间会较短,表达时间在1 个月以内,但以骨骼肌为靶组织,表达可持续15个月。
3、活体电穿孔法与其他活体基因导入方法的比较到目前为止,非病毒载体的活体基因导入方法有直接注射法、脂质体法、基因枪法、电穿孔法等。
每一种方法都有其各自的特殊性,因此很难将这几种方法进行简单的比较。
直接注射法：可将外源基因直接注射到靶位点或血管中,但此种方法不适合以肌肉作为靶器官,它的外源基因表达效率极低,仅为电穿孔法的百分之一。
脂质体法：活体基因转移法中脂质体法更适宜较大面积组织的基因导入,但无法避免DNA浓度变低,在出血的情况下会使本来不高的DNA浓度更加降低,往往造成基因导入效率低。
基因枪法：适合于DNA较易接触到的质地较坚韧的组织如皮肤,而视网膜、胚胎和禽类的胚盘等组织会由于机械刺激和出血造成器质性损伤或发育停滞,因而不能用基因枪法完成。
DNA包裹的金属颗粒从基因枪发出到达组织表面大多只几百微米的距离,较深层的组织不易操作, 表达效率也较低。
Muramatsu报道在材料一致的情况下,电穿孔法的基因导入和表达效率明显高于其它方法,而且电穿孔法适合多种组织的操作[3 ] 。
4 活体电穿孔法施加条件的研究波型的选择在电穿孔过程中方波较指数衰减波更能获得较高的基因表达。
同时方波只要要求控制电压和时间，十分直观，而指数衰减波需要控制的电压、电容、电阻等参数，这样的条件摸索过程中，方波较指数衰减波更易得到高表达。
电压电穿孔时在能量导入一定的情况下设计施加电压的值。
电压过低或过高都会影响外源基因的表达。
电压过低时,无法造成细胞膜表面状态的改变,因而外源D不能进入细胞内。
电压过高时,局部组织积聚过多热量,造成细胞的死亡或组织失去功能,即使外源基因导入细胞,也无法进行正常的表达。
哺乳动物常用的活体电压大多为20～100VPcm ,最高电压在250～750VPcm。
电穿孔次数和时间有试验证明,皮肤的电阻在每一次电穿孔后都有所降低，说明电穿孔使皮下组织形成孔道,且其大小随电穿孔而变大,经过电穿孔的处理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊内表达。
但电穿孔次数不能过多,否则会对局部的细胞组织造成不可逆的损害,基本应在10 次以内,每组电穿孔时间应在20～100msec 。
能量的测算电穿孔过程中能量的测算公式为: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表电穿孔时导入的能量,V 代表施加的电压,T 代表电穿孔延续的时间,R 代表作用组织的电阻。
试验证明在导入能量一定的情况下外源基因转移效率也相近。
在此原则基础上可根据不同的组织器官选择不同的电压和电穿孔时间。
温度由于电穿孔瞬间在局部会产生大量热,因此操作过程中,DNA 转染试剂应保持4 ℃,同时电穿孔操作部位的温度也应适当降低,Muramatsu 证明温度较低的情况下,外源基因的转移表达效率会有明显的提高。
此外在电穿孔操作部位温度降低的同时可以有效抑制局部组织的出血和外源DNA 的流失,这样也在一定程度上保证了基因的导入效率。
DNA 的状态和浓度很多试验都证明线状DNA 较环状DNA 在活体电穿孔法瞬时表达系统的建立中效果较好[12 ] 。
DNA 的浓度应在1～40mgPml 范围内。
DNA 溶液组分DNA溶液中不应含有不能分解成离子的组分,如甘露糖醇、蔗糖等。
这些大分子存在时会降低基因的转移效率。
5、活体电穿孔法在不同组织上的应用肌肉组织在肌肉组织中最初进行外源基因活体导入是采用电穿孔法。
选择肌肉组织作为靶组织是因为肌肉组织在体内所占比例很大,约占40 % ,而且外源基因可在肌肉中长期表达、分泌,在基因治疗中经常会用到。
此外,外源基因也不会因肌细胞的分裂而丢失。
皮肤皮肤组织相对于其他组织较难进行电穿孔法的基因导入,因为皮肤比较薄,电阻相对低,要求电流较高。
但如果电流过大,会严重影响基因的表达,因此应适当降低电流和电压,延长电穿孔的时间。
另外,由于皮肤组织含有的脂肪细胞分布不均,会干扰电穿孔的作用,因此只推荐用镊状电极,且应将动物被毛刮净后操作。
虽然外源基因在皮肤中表达的时间较肌肉中短,但可利用活体电穿孔法对很多皮肤疾病进行治疗。
肝脏由于肝脏的生理代谢十分旺盛,因此外源基因在肝脏中的表达时间往往很短暂,而且表达产物的水平也较低。
为减少出血,可从小静脉注入，然后在肝脏上施加电场,能显著增强基因的表达。
睾丸相对于其他的转基因方法,活体电穿孔法可使外源基因在睾丸中产生大量和持久的表达。
此外,很多研究人员希望利用活体电穿孔法将外源基因导入精子, 进而通过授精得到转基因动物。
Yamazaki 等[13 ] 和Ryoki 等[14 ] 用甲磺酸丁二醇二酯注射或用手术法将动物人为造成隐睾,大部分体细胞和分化了的精母细胞减少,这样使外源基因导入精原细胞的几率增加。
Ryoki 等[14 ] 将基因与病毒诱导的整合酶基因共转染,可在精原细胞中检测到外源基因的表达,且病毒诱导的双基因共转染较单基因整合效率更高。
但目前用这种方法获得转基因动物还较难。
禽类输卵管对禽类输卵管活体电穿孔的研究很少,但这一方法却有很广阔的发展前景。
因为输卵管腺体细胞具有很强的分泌功能,可以将大量蛋白分泌到鸡蛋中。
也可以利用此瞬时表达系统检测含卵清蛋白启动子的载体功能。
Park 等用活体电穿孔法以荧光素基因导入鸡输卵管上皮,检测到荧光素活性约4500RLUPmg 组织[15 ] 。
眼睛、胚胎和禽类胚盘这三种组织都是很脆弱的,如果实施基因枪法,会使靶组织因强烈的机械损伤而失去功能或直接导致发育停滞。
Sakamoto 将血纤蛋白溶酶原激活因子基因导入眼睛中,有效抑制了眼睛在淤伤后血纤蛋白的反应。
哺乳动物胚胎的电穿孔操作包括离体和子宫内操作。
禽类胚胎基本是在蛋壳中进行电穿孔的,而且表达快速,Momose 等报道电穿孔施加后215 小时在鸡胚中就可以检测到外源基因的表达,这在使用病毒载体时也是不可能的。
当电场被限定在一个很小的范围内时,基因可以定点表达, 这是活体电穿孔法的又一优点,Katahira 等[17 ] 证实可将外源基因导入鸡胚大脑、心脏和一些微小组织(如中胚层,间充质和体节) 中进行表达。
6、活体电穿孔法进行基因治疗及外源基因表达的调控6．1 活体电穿孔法在基因治疗方面的应用原来在基因治疗中利用活体电穿孔法将抗体或化疗药物导入肿瘤中,促进抗体和化疗药物的运送来进行治疗,现在则以特异的外源基因替代了抗体的应用,简化操作步骤同时降低了费用。
首先,在皮肤瘤和脑瘤的治疗中,电穿孔法可有效地将药物基因导入治疗部位。
电穿孔法导入人单核细胞趋化物蛋白基因到大鼠脑瘤后,该蛋白在肿瘤的局部表达,同时在基因导入的部位可观察到巨噬细胞和白细胞的聚集。
同时有科学家从另一角度研究电穿孔对治疗肿瘤方面的作用,利用高电场强度的陡脉冲促使肿瘤细胞发生不可逆性电击穿而最终死亡,这种方法很适于局部组织肿瘤的治疗。
此外,活体电穿孔法还可以参与癌症的治疗,通过活体电穿孔法将基因导入机体后,导入组织可成为分泌抗体等物质的临时分泌器官,以抵抗癌细胞的侵蚀或代偿由于癌细胞的侵蚀而造成的机体多种生理机能的丧失。
除了可以利用活体电穿孔法对肿瘤进行局部治疗外,还可以治疗机体的内分泌系统和免疫系统的疾病。
可在机体局部以活体电穿孔法导入编码分泌型蛋白的基因,这种重组的治疗蛋白可以随着血液循环分布到全身各种组织和细胞进行治疗。
如在活体电穿孔骨骼肌导入EPO 基因后,可通过红细胞比容值检测到EPO 基因表达产物的增加。
Yasui 等在小鼠体内检测到活体电穿孔法导入的胃泌素基因的表达产物和人的单克隆抗体。
在不远的将来,研究人员可以选择机体的一种组织的某个位置作为活体电穿孔的靶位点,将治疗基因从该位点导入进而表达,因此又可以把这个特殊的组织当作机体的一个人造的内分泌或免疫组织,对病人进行相应的治疗。
活体电穿孔法可对系统疾病产生作用并且安全有效。
将不同类型的耐药基因同时导入造血细胞,以扩大耐药范围和进行体内选择是基因治疗的重要策略,这类载体基因片段大多较长,进行传统基因导入有一定的难度。
有报道可以用活体电穿孔法将醛脱氢酶基因和多药耐药基因共转移并在PA317 细胞中获得高效表达,转导率达98 % ,测定药物蛋白表达较常规方法增高4 倍。
此外电穿孔法有很高的经皮促渗作用,可进行很多经皮给药的治疗。