重组质粒电穿孔转染条件探讨
重组质粒的连接、转化及筛选
重组质粒的连接、转化及筛选概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。
通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。
也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。
由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。
所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。
还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。
带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
ti质粒转化的原理
ti质粒转化的原理质粒转化是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，它能够将外源DNA导入到目标细胞中。
这项技术在基因工程、遗传转化和生物制药等领域具有重要的应用价值。
在本文中，我们将深入探讨质粒转化的原理，并分享对这个主题的观点和理解。
一、质粒转化的原理质粒转化的原理是通过改变细胞膜的通透性，使质粒能够进入目标细胞。
这样一来，外源DNA就能够在目标细胞内进行重组和复制。
下面将介绍两种常见的质粒转化方法：热激转化和电穿孔转化。
1. 热激转化热激转化是一种利用温度和钙离子改变细胞膜通透性的方法。
目标细胞在低温条件下与质粒一起处理，使细胞膜发生冷冻/融化循环。
接下来，细胞在高温条件下暴露于热激，此时细胞膜通透性增加，质粒得以进入细胞内。
将细胞培养在适当的培养基上，质粒就能够在细胞内进行复制和表达。
2. 电穿孔转化电穿孔转化通过应用电场脉冲的方式改变细胞膜通透性。
目标细胞和质粒混合，形成电穿孔转化液。
将电穿孔转化液暴露于电脉冲中，电场脉冲使细胞膜产生瞬时的微小孔洞，从而使质粒得以进入细胞内。
将细胞培养在适当的培养基上，质粒能够在细胞内进行复制和表达。
二、观点和理解质粒转化作为一项重要的分子生物学技术，具有广泛的应用前景。
通过质粒转化，我们能够将感兴趣的外源DNA导入到目标细胞中，进行基因操作和功能研究。
这项技术在基因工程领域有着重要的应用，例如构建重组蛋白表达系统、揭示基因调控机制以及研究细胞信号通路等。
作为文章写手，我认为质粒转化的原理和方法对于理解基因操作和基因功能的研究具有重要意义。
通过质粒转化，我们能够探索不同细胞中的基因表达方式、调控机制以及细胞间的相互作用。
这对于研究生物学中的许多重要问题，如发育生物学、细胞信号传导、肿瘤发生等，提供了强有力的工具和方法。
质粒转化不仅在基础研究中有着广泛应用，也在农业、医药和生物制药等应用领域发挥着重要作用。
通过质粒转化技术，我们能够将外源基因导入植物细胞中，创造出具有特定性状的转基因植物。
重组质粒导入细胞的方法
重组质粒导入细胞的方法重组质粒导入是一种常用的基因转染技术，它将外源DNA导入到目标细胞内，经过DNA定向插入和表达，使研究者能够在细胞和组织模型中对基因和蛋白质的功能和行为进行研究。
本文将介绍重组质粒导入细胞的方法。
一、化学法转染化学法转染是最传统的基因转染方法之一，主要优点在于操作简单、适用范围广，不需要任何特殊设备或技能。
化学法转染的工作原理是利用一种封闭性较强的转染剂（例如聚乙烷醇）将目标质粒导入到细胞内。
虽然化学法转染方法简单，但其转染效率通常较低，DNA损伤和细胞毒性都会影响转染效果。
二、电穿孔法转染电穿孔法转染是一种利用电场导致细胞膜通透性改变增强质粒DNA导入效率的方法。
在电穿孔法转染前，将目标细胞与DNA及电极置于石墨电极板之间，应用连续的高压电脉冲将DNA导入到细胞内。
这种方法在独立单元上进行转染，非常适合小规模的试验。
电穿孔法转染具有高效性和灵活性，但也存在一些局限，如只能转染特定类型的细胞，而且该方法的DNA递送不是特别生物稳定。
三、超声波法转染超声波法转染是目前使用最广泛、最有效的基因转染技术之一。
利用高强度超声波打破细胞壁和细胞膜，让DNA等外源分子透过细胞膜，进入细胞内。
这种方法无需使用化学或物理转染试剂，不会引起毒性或细胞破坏。
因此，超声波法转染是一种相对安全、简单、快速高效的细胞转染技术。
但由于超声波聚焦效应难以控制，其应用范围有一定的限制。
四、病毒载体法转染病毒载体法是一种基因转染方法，把表达目标基因的所需DNA片段嵌入virus vector，再将其加入到细胞培养基中，由病毒携带入细胞，通过表达相关的基因来达到其作用。
这种方法具有高效性和高选择性，已被广泛应用于分子和细胞生物学和基因工程等领域。
五、染色体介导法转染这种转染方法利用已存在于基因组中的序列，将目标序列插入到它的喉管上，依赖于细胞的DNA修饰系统，将目标DNA插入到靶标染色体的特定位点上。
染色体介导法转染无需使用外源RNA、DNA分子，也无需添加任何刺激物，相对于其他转染技术更加可靠和可重复。
细胞的脂质体转染法和电穿孔法
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。
二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。
三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。
附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。
电穿孔法转染细胞原理
电穿孔法转染细胞原理
电穿孔法转染细胞是一种常用的基因转染技术，它利用高压电脉冲破坏细胞膜，使外源DNA进入细胞内。
其原理如下：
1. 电场诱导细胞膜孔洞形成
电穿孔法转染细胞的第一步是利用高压电脉冲产生强电场，电场的作用下，细胞膜内部的离子和分子会发生移动，形成孔洞。
这些孔洞的大小和数量取决于电场的强度和持续时间。
2. DNA进入细胞内
一旦细胞膜形成了孔洞，外源DNA便可以通过孔洞进入细胞内。
这些DNA分子可以是裸露的质粒DNA，也可以是DNA与载体复合物。
3. 细胞修复孔洞
在电穿孔的过程中，细胞膜受到了破坏，但细胞会尽快修复这些孔洞。
细胞膜修复的过程中，外源DNA可能会被稳定地整合到细胞基因组中，从而实现基因转染。
总的来说，电穿孔法转染细胞利用高压电脉冲破坏细胞膜，使外源DNA进入细胞内，然后通过细胞修复孔洞的过程，使外源DNA整合到细胞基因组中。
这种技术可以用于基因敲除、基因表达、基因编辑等多种研究应用。
电穿孔转染质粒DNA
质粒的构建：1. 酶切反应按照1ugDNA需1-10u内切酶的用量，在反应体系中加入相应的10×缓冲液，内切酶的体积不得大于总体积的十分之一，ddH2O补足体系，如需长时间消化，还需加入适量的BSA 已稳定内切酶活性。
2. DNA片断的回收欲回收的DNA片断经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所需片断所在的凝胶（胶的体积尽可能小），加入3倍体积的BufferQX1,及适量的QIAXⅡ(Glassmilk),55℃10分钟，每隔2分钟涡旋1次，待凝胶完全溶解，12000转离心1分钟，BufferQX1洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶.。
再用BufferB洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O,离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。
3. DNA片断3凹端的补平于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul,加水至19ul。
然后加入1-5单位Klenow酶，混匀后室温下反应15分钟。
待补平反应结束后，于65℃水浴20分钟使Klenow酶失活，电泳定量后即可用于连接反应或-20℃保存备用。
4. DNA片断3凸端的补平于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul。
,加水至19ul。
然后加入1-2单位T4噬菌体DNA聚合酶，12℃温育15分钟，于75℃加热10分钟，使T4噬菌体DNA聚合酶灭活。
5. 载体的脱磷酸化：载体质粒经内切酶酶切后可直接进行脱磷酸化处理。
40ul的酶切反应体系，景点永建车酶切完全后可加入10×CIAP（牛小肠碱性磷酸酶）缓冲液5ul,水4ul和适量CIAP进行脱磷酸化反应。
CIAP的用量依载体5端磷酸的摩尔数及末端性质而定，对于5突出的末端，每100pmol 5末端磷酸需1单位CIAP，对于5凹端或平末端，每2pmol 5端末端磷酸需1单位CIAP,一般2ug 5kb的线性化质粒DNA约翰1.4pmol 5端磷酸。
细胞的脂质体转染法和电穿孔法
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。
二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。
三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。
附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。
电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化
电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化(作者：___________ 单位： __________ 邮编：___________ )作者：单铁英苏安英唐军民【摘要】目的：通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因(enhan ced gree n fluoresce nt protein EGFP )的真核表达载体plRES2-EGFP( IRES2 in ternal ribosome en trysite 2 内部核糖体进入位点2)质粒导入未成熟树突状细胞( Immature Den driticCell,imDC)，探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响。
方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，采用细胞因子体外培养诱导其成为imDC在大肠杆菌中扩增plRES2-EGFP质粒，选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等。
应用电穿孔仪将PIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，荧光显微镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数。
0.4%锥虫蓝(trypan blue) 染色，计数电转染后细胞存活率。
结果：当imDC浓度为5X 106/mL 与6卩g DNA质粒混合，设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 卩s时,其电转染率到最高，细胞存活率最高，转染后24 h明显表达，48h后表达最强。
结论：在适当的电压、脉冲时间下，选择适当的细胞浓度、DNA剂量，在转染后的一定时间范围内，电穿孔法转染imDC可使目的基因获得较高的转染率，且细胞死亡最少。
电转染提供了外源基因转染imDC的可行技术。
【关键词】电穿孔转染绿色荧光蛋白树突状细胞Abstract Objective:plRES2-EGFP was successfully tran sfactedinto immature dendritic cells by means of electroporation in order to investigate the effect of electransfection efficiency and survival rate of immature dendritic cells in different con diti ons.Methods:M ono cytes obta ined form huma n peripheral blood by density guadient centrifugation are induced into imDCs in the presenee of cytokines in vitro.plRES2-EGFP was amplified inE.coli.imDCs were tran sferred with pIRES2-EGFP by means of electroporati on with differe nt electric voltages,times of impulse,cell concen trati onsand the doses of DNA.Numbers of green fluorescence positive cells and the total cell number were coun ted respectively un der fluoresce nt microscope and visible light microscope.the cells were stained with 0.4% trypan blue,electransfection efficiency and the cell survivalrate were counted.Results:Electransfection efficiency wasin creased to the highest value whe n imDCs with theconcentration of 5X 106 cells/mL were mixed with 60 卩g-total DNA,the electric voltage of electroporation apparatus was set at 300V,and the time of impulse was 500 卩s.There wassig ni fica nt and the highest expressi on of plRES2-EGFP respectively at 24 h and at 48 h after tran sferri ng.C on clusio n:A higher tra nsfecti on efficie ncy of target genes can be obta ined by means of electroporati on with suitable electric conditions.Electric transfection provides atech ni cal possibility to make DNA into imDCs.Key words Electroporati on; Tra nsfect;Gree n fluoresce nt protein;Dendritic cell;Human树突状细胞（dendritic cell,DCs ）作为体内惟一能活化初始T细胞的抗原递呈细胞（antigen presentingcell,APC），是激发机体特异性免疫反应的关键，其在抗肿瘤免疫治疗领域中的作用受到广泛关注，以DCs为基础构建的各种类型的疫苗在多种肿瘤免疫治疗的基础和临床研究中显示了旺盛的生命力和良好的前景[1,2] 。
电穿孔法转化大肠杆菌TG1的条件优化
药 物 生 物 技 术Pharmaceutical Biotechnology 2001,8(3):143～146电穿孔法转化大肠杆菌TG1的条件优化Ξ李 南,凌世淦2,吴梧桐1(11中国药科大学生物制药学院,南京210009;21军事医学科学院基础医学研究所分子病毒学实验室,北京100850) 摘 要 研究了质粒pFab74X经电穿孔转化大肠杆菌TG1菌株的影响因素,并优化其转化条件。
电场强度和脉冲时间的影响较为复杂,两者适当组合才可获得高转化效率。
此外,采用对数生长早期的细菌,提高细菌浓度和降低筛选用氨苄青霉素的浓度均可提高转化效率。
关键词 电穿孔;转化效率;大肠杆菌TG1中图分类号:Q68,Q936 文献标识码:A 文章编号:100528915(2001)0320143204 构建cDNA文库或基因文库时,转化效率高低是决定其多样性的关键因素之一。
但常用的磷酸钙及原生质体等转化法转化效率均较低,批间差异较大,转化后再生时间长。
电穿孔法(E lec2 troporation)则较好的解决了这个难题,它是利用瞬间高压电脉冲作用于受体细胞,使细胞表面产生暂时性的孔隙,从而将DNA、RNA、蛋白质等多种生物分子或颗粒导入胞内的方法,也称为电转化法。
由于电穿孔是一个物理过程,适用范围广,转化效率高,特别是针对易受溶酶体消化的生物分子[1]及没有合适遗传转化系统或转化效率低的细胞,效果显著。
目前,电穿孔法已经广泛应用于生物学、医药学、食品学等各个领域,成为转化细胞的常用方法。
电穿孔法最早是应用于真核细胞。
1982年, W ong和Neumann成功的用电穿孔法转化小鼠成纤维细胞[2],但效率不高。
现在,由于技术改进,操作简便快速,转化效率高,已广泛应用于原核细胞外源生物分子的导入。
但影响转化效率的因素众多,不同的电穿孔体系[3]、受体细胞[4]、外源生物分子[5],其最佳转化条件均有一定差异。
因此要获得高转化效率必须寻找这些因素的最佳组合。
293t细胞电转染条件
293t细胞电转染条件293T细胞是一类广泛用于在生物医学研究中表达重组蛋白质的细胞，其具有易于转染的优点，可以通过电转染等方法实现高效率的转染。
以下是293T细胞电转染的一些常见条件及注意事项。
1.细胞密度：293T细胞在转染前应达到80%的密度，这可以提高转染效率。
密度过高或过低均会影响转染效果。
2.质粒DNA：选用高质量的质粒DNA，应避免污染。
DNA质量不好、含盐离子等污染物质均会导致转染效率下降。
3.转染试剂：电转染试剂通常由DNA、细胞和电转染缓冲液组成，不同品牌的转染试剂组成可能不同。
4. 电穿孔仪：目前广泛采用的电穿孔仪为AMAXA品牌的Nucleofector®，根据细胞类型及目的有不同的穿孔条件，可以在AMAXA公司官网中查询。
5.转染时间：对电转染的转染时间尚无统一标准，需要结合实验室条件和试验要求等因素，进行参数优化。
6.电压和电容量：电压和电容量是影响转染效率的重要因素。
要根据细胞类型、质粒DNA和穿透液等试剂的要求进行调整。
7. 转染缓冲液：转染缓冲液是电转染的关键因素之一、目前常用的缓冲液有DMEM、Opti-MEM、PBS等。
应根据质粒DNA的要求选择合适的缓冲液。
8.孵育条件：在电转染后需要对细胞进行适当的孵育，以促进质粒DNA的表达。
9.转染后处理：电转染后需根据需要添加适当的选择抗生素，以筛选包含肿瘤抗原基因的细胞。
综上所述，293T细胞电转染具有高效、简单、经济且可重复的优点，成为目前最为常用的转染方法之一、在实验设计和参数优化时，需要注意选择合适的试剂和仪器，优化电压和电容等参数，合理选择转染后的处理及分析方法，以获得准确、可靠的实验数据。
电穿孔转染条件
电穿孔转染条件《电穿孔转染条件》我有个在生物实验室里工作的朋友，叫小李。
有一次，我们一起吃饭的时候，他就一直在那唉声叹气的。
我就问他：“怎么了呀？是实验不顺利吗？”他皱着眉头跟我说：“哎，就那电穿孔转染，这条件总是找不准，做了好多次，结果都不是很理想。
”我当时就好奇，电穿孔转染是啥高级玩意儿啊？小李就开始给我解释，说简单来讲呢，就是利用电脉冲在细胞膜上形成临时的孔，好让外源基因之类的能进去细胞。
但是这个电穿孔转染啊，条件太关键了，这不好把握啊。
就这样，我今天就想给大家好好聊聊“电穿孔转染条件”这事儿。
咱们先来说说电压这个条件。
这就像给细胞盖房子时选择盖房子的力量一样，电压太小呢，就好像轻轻推了一下细胞，没办法形成足够大或者足够多的孔让那些基因进去，那转染效率肯定就低。
但是电压太大也不行啊，那细胞怕是得被你这个外力给弄崩溃啦，可能直接就死翘翘了。
就像小李那次，他把电压调得太大了，结果一看细胞，大部分都不行了，数据肯定也是一塌糊涂。
再讲讲脉冲时间。
这个因子也很微妙呢。
脉冲时间太短，就跟闪了一下似的，细胞膜上的孔都来不及好好形成稳定的通道，基因进去的机会就少得可怜。
要是脉冲时间太长，细胞也会不高兴的，它可能就开始采取自我防御机制之类的，像把刚刚打开的孔给关上啦，或者对进入的基因进行破坏，这转染可就失败了呀。
细胞密度也在这个电穿孔转染里起着重要角色呢。
要是细胞太稀了，就好比在一个空荡荡的大广场上做穿孔实验，电脉冲传导分布会很不均匀，而且整体效果也不好。
但细胞要是太密了，就像在沙丁鱼罐头里搞事情一样，每个细胞受脉冲影响的程度也是有差异的，也会影响转染效果。
还有啊，那电极的间距也不容小觑。
这就像发射信号的两个塔之间的距离一样，间距不合适，形成的电场就不对劲儿，也没法让细胞们乖乖听话接受转染。
我觉得啊，想要把电穿孔转染条件弄好，就得像照顾小孩一样细心。
首先，仔细查阅相关的文献资料是必不可少的，看看那些成功的例子是怎么设置条件的。
转染技术2
pcDNA3.1-GFP转染细胞实验2009年08月07日09时21分55秒来源：未知浏览：286次【原理】外源基因进入细胞主要有三种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法，实际上其基本原理都是利用不同的方法在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入，但是由于前两者的效率低且伤害较大，所以现在除了对于一些特殊细胞系，一般的转染方法都利用脂质体。
利用脂质体转染和其他方法一样，最重要的就是防治其毒性，因此脂质体与治理的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
本实验学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。
了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白）。
【试剂与仪器】1 ．小牛血清。
2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素 100 单位）。
3 ． DMEM 培养基。
4 ．转染试剂（ LIPOFECTAMINE 2000 ）。
5 ．细胞培养基（ DMEM+10%NCS ）。
6 ． PBS 。
7 ．无血清培养基。
8 ．胰酶（ Trypsin ）。
9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机， 15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和 CCD 。
【操作步骤】1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为 90% 。
细胞铺板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中（参见表 6 了解建议的细胞密度）。
2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清 DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。
多孔操作可以批量制备。
3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。
LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在 5 分钟内同稀释的 DNA 混合。
电穿孔法转染脐带华通胶间充质干细胞的最佳条件
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2018)17-02717-05 2717www.CRTER .org·研究原著·王泽，女，1991年生，安徽省池州市人，汉族，安徽医科大学海军临床学院在读硕士，主要从事干细胞治疗的研究。
通讯作者：陈宇，博士，博士后，副主任医师，硕士生导师，安徽医科大学海军临床学院，北京市 100048；解放军海军总医院心血管内科，北京市 100048中图分类号:R394.2 文献标识码:A稿件接受：2018-05-15Wang Ze, Master candidate, the Navy Clinical College of Anhui Medical University, Beijing 100048, China; Department of Cardiology, Navy General Hospital of PLA, Beijing 100048, ChinaCorresponding author: Chen Yu, M.D., Associate chief physician, Master ’s supervisor, the Navy Clinical College of Anhui Medical University, Beijing 100048, China; Department of Cardiology, Navy General Hospital of PLA, Beijing 100048, China电穿孔法转染脐带华通胶间充质干细胞的最佳条件王 泽1，2，李春花2，张宁坤2，高连如2，陈 宇1，2 (1安徽医科大学海军临床学院，北京市 100048；2解放军海军总医院心血管内科，北京市 100048)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0870 ORCID: 0000-0001-7316-7168(王泽)文章快速阅读：文题释义：脐带华通胶间充质干细胞：脐带华通胶间充质干细胞富含透明质酸，占脐带中黏多糖的70%，形成成纤维细胞周围的水凝胶结构，确保脐带中不仅含有大量的胶原纤维，还包括大量增殖能力极强的间充质干细胞。
电穿孔质粒DNA转染
电穿孔质粒DNA转染作为一种基因转导办法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射办法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞内。
与其他常用的导入外源物质的办法相比，电穿孔具有无数优点。
首先，不必像显微镜那样用法玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞举行注射。
其次，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。
第三，由于电穿孔是一种物理办法，较少依靠细胞类型，因而应用广泛。
事实上，对大多数细胞类型，用电穿孔法基因的转移效率比化学办法高得多。
试验原理当细胞置于十分高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子蔓延进细胞内，这一现象称为电穿孔。
运用这一技术，许多物质，包括DNA、 RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞内。
材料（试剂及设备） (1) 缓冲液与溶液PBS缓冲液（配方参考《分子克隆试验指南》）。
(2）核酸与寡核苷酸质粒DNA：转染前将所要转的质粒在细胞室内无菌沉淀（1/10体积的3moUL NaAC, 2倍体积的无水乙醇），在超净台中用70％的乙醇（无水乙醇与灭菌水在无菌状态下配制）清洗2次，晾干，加灭菌水溶解。
用0. 1×TE（pH 7.6)溶解DNA至终浓度25 μg/ml，每毫升培养基需要50μl质粒溶液。
(3）培养基：为彻低培养基。
(4）其他设备电穿孔仪、细胞培养用培养箱（(37℃, 5% CO2的加湿培养箱）、超净台、冰箱、离心机、Vortex 振荡器（选用）、1. 5mlEP管、移液器及tip头、试管架、计时器和60mm组织培养皿或12孔板。
(5）细胞：指数生长的哺乳动物细胞培养物。
细胞预备：转染前一到两天将细胞传代至平皿中（视目的不同所用平皿规格不同），使细胞密度在做转染时达到所需密度（详细细胞密度视细胞生长速度而定，标准是在收细胞时细胞密度达到100%）。
转染办法 (1）贴壁细胞用胰酶消化后离心（室温，1000r/min, 3min）收集细胞，悬浮细胞挺直离心收集细胞。
质粒DNA转染实验指导
质粒DNA转染实验指导质粒DNA转染细胞生物学研究中，需要针对某个基因和蛋白质的功能进行特定研究，因此需要应用外源性导入的方法将这一外源基因表达，进而研究其一系列生物学功能。
转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
本次实验采用罗氏的X-tremeGENE HP DNA非脂质体转染试剂，作为携带质粒穿膜的载体物质，具体介绍DNA转染方法。
一、细胞准备转染前一天，取出处于对数生长期的健康细胞，吸掉原来的培养液，用无菌PBS清洗细胞。
加入1毫升胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入终止液终止消化。
采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式。
收集细胞悬液于15毫升离心管中，每分钟800转，室温离心5min。
用罗氏CASY快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。
弃去上清，加入培养基重悬细胞。
以每孔3至5×105细胞密度接种到6孔培养板上，在无抗生素培养基中培养一天。
具体数量因细胞种类不同而不同，掌握为转染时使细胞达到80％～90％的融合率。
转染前3小时，取出无抗生素培养的细胞置于倒置显微镜下观察。
若融合率达80％～90％，即可进行转染实验。
请注意，如使用传统的转染试剂，细胞培养物必须去血清培养，否则会影响转染效率。
但本实验所采用的X-tremeGENE HP转染试剂无需去血清二、耗材及试剂准备实验开始前，准备好所需的Optimem I无血清培养基，去核酸酶EP管，经高压灭菌的200微升和1毫升枪头各一盒枪头，以及罗氏X-tremeGENE HP DNA转染试剂等。
三、细胞转染首先进行转染试剂复合物的制备。
在已标记好的EP管中分别加入100微升Optimem I无血清培养基采用1微克质粒：100微升OptimemI稀释质粒DNA。
质粒电穿孔转染条件的选择
质粒电穿孔转染条件的选择杨薇;王迪;陈克清;于敏;王桂华;胡俊波;王晶【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(38)6【摘要】@@ 电穿孔转染,作为物理方法的一种,出现于20世纪80年代中期~([1]).这种方法不仅能够将DNA、RNA,还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞.它是一种高效、简便的基因转移系统,具有其它转移方法无可比拟的优越性,如操作简便、快捷,可重复性强,转染率高,适用谱广等.【总页数】3页(P858-860)【作者】杨薇;王迪;陈克清;于敏;王桂华;胡俊波;王晶【作者单位】华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院分子医学中心,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院分子医学中心,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】R331【相关文献】1.SEA和喉癌MAGE-A3构建的真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA经过电穿孔转染在小鼠体内的转录 [J], 李宁;吉晓滨;谢景华;刘启才2.基于柔性微电极芯片活体电穿孔提高PD-1质粒DNA转染效率 [J], 张卫凯;胡志远;李智涛3.质粒DNA转染人PBMC电穿孔条件的影响因素 [J], 孔明圣;于洋;张亚倩;李玲;张文峰;邵红伟4.质粒DNA转染人PBMC电穿孔条件的影响因素 [J], 孔明圣;于洋;张亚倩;李玲;张文峰;邵红伟;5.重组质粒电穿孔转染条件探讨 [J], 周智;张定凤;任红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
电穿孔法转染293T细胞条件的优化
电穿孔法转染293T细胞条件的优化
刘晓娟;赵晓飞;曾贝妮;张萌;马正海
【期刊名称】《生物学通报》
【年(卷),期】2014(49)11
【摘要】为筛选电穿孔转染人胚肾293T细胞的最优条件,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆至启动子pCMV前,获得的重组质粒在不同电压、质粒浓度和电击次数条件下电穿孔转染293T细胞,继而在倒置荧光显微镜下观察转染细胞,根据EGFP表达情况评价转染效率.结果表明400 V电压、45 mg质粒电穿孔转染293T细胞2次时转染效率达到44％,与脂质体转染效率(51％)无统计学差异.【总页数】3页(P52-54)
【作者】刘晓娟;赵晓飞;曾贝妮;张萌;马正海
【作者单位】新疆大学生命科学与技术学院新疆乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院新疆乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院新疆乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院新疆乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院新疆乌鲁木齐830046
【正文语种】中文
【中图分类】Q785
【相关文献】
1.树突状细胞电穿孔法转染条件的优化 [J], 鲁世绒;
2.Jurkat T细胞电穿孔转染条件的优化 [J], 张高丽;隋娟;刘喜红;李平法
3.电穿孔法高效转染脑胶质瘤细胞U251的条件优化研究 [J], 牛丽丽;王秀娟;张传领;温建勋;姜丽丽;王忆霄;王叶庭;肖瑞
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5.电穿孔法转染人乳腺癌细胞MCF-7的条件优化研究 [J], 闫东科; 许凤霞; 吕平; 李冬
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电转染实验注意事项
电转染实验注意事项
1. 选择合适的电场强度
合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。
不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。
2. 细胞的选择
用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。
因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.
3. 质粒的质量
应选择纯度高的质粒，首先DNA／RNA应该超纯(A260／A280>1．8)，其次应不含内毒素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE 缓冲溶液。
另外，DNA浓度不宜过高。
4. 选择合适的电转染试剂
电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如engreen的Entranster-E，可将电击对细胞的损伤降到最低。
并且，Entranster-E可适用于lonza、Bio-rad、BTX等多种电转仪。
【doc】重组质粒导入真核细胞的两种方法比较
重组质粒导入真核细胞的两种方法比较280泸州医学院2001年第24卷第4期JournalofLllTJlollMedicalCollegev0I24No.42001重组质粒导入真核细胞的两种方法比较陈枫,张建军,钟森(泸州医学院附属医院传染与免疫研究室,泸州64~oo)摘要目的:比较糖化多秉赖氨酸介导和电穿孔两种方法将重组质粒导人真核细胞的优缺点.方法:用最佳电压,电容,温度,DNA浓度进行电穿孔转染,或者先使重组质粒与糖化多聚赖氨酸电性结台后,再与2,2.15细胞共同温育的方法,分别将pcEP4一aC重组质粒导^2.2.15细胞,经潮霉素筛选,比较两种方法的优劣结果:两种方法都能成功地将重组质粒导人2.2.15细胞,但糖化多聚赖氨酸介导者,细胞生存时间较长结论:糖化多聚赖氨酸导向配体具有良好的导人重组质粒进人肝细胞的功能,且更适台于应用关键词外源基田:电转染;糖化多聚赖氨酸;导向中图分类号Q243文献标识码A文章编号10130—2669(2001)04—0280—03目前已经建立了多种成功方法,将重组质粒导人哺乳动物细胞.但无论采用何种方法将DNA导人细胞,很大程度上取决于细胞型别.在一种培养细胞上行之有效的方法,在另外一种细胞可能毫无作用.因此,有必要根据具体研究的情况,选择最佳的方法,将外源基因成功地导人细胞.1材料和方法1.1材料针对I-IB~C区的反义基因真核表达质粒peEP4一ac由本研究室构建…,能转录549核苷酸的c区反义RNA;糖化多聚赖氨酸由军事医学科学院王升启教授惠赠;2.2.15细胞抹由重庆医科大学病毒性肝炎研究所惠赠,能转录,翻译I-IBV基因,表达liB. sag和HBeAg;潮霉素为Sigma产品;HB~As和HBeAg 检测试剂盒为上海科华公司产品;HBV—DNA斑点杂交试剂盒为上海医科大学预防研究所产品.主要仪器有c02细胞培养箱(美国Numir产品);电穿孔仪器型号165—2110.1.2研究方法1.2.1细胞培养按照文献方法进行.实验时将生长良好的2.2.15细胞调整浓度为5×I/nil.实验分为3组,即①糖化多聚赖氨酸组,②电穿孔转染组,③对照组不导入外源基因.1.22外源基因的靶向导入1)糖化多聚赖氨酸组:将糖化多聚赖氨酸溶于PBS缓冲藏中(终浓度10%),按1/LgpcEP4一aC,陈枫(1963一).女,主管技师.0.31糖化多聚赖氨酸的比例(预试验最佳比例)混合,室温下反应半小时(成为靶向混合物)后应用.取[】.8ml浓度为5xl/ral的2.2.15细胞,加入3ota靶向混合物,轻轻混匀,37℃,5%CO2条件下继续培养,于48小时加入潮霉素后,显微镜下观察细胞生长和死亡情况.2)电穿孔转染组:采用本研究室优化方案进行:取0.8ml浓度为5×I/ml的2.2.15细胞,加30td浓度为l的重组质粒,混合后置4℃10分钟,选择电压210V,电容975uf,时间16ms,电击,迅速将打击槽置于4℃,10分钟后放人37℃,5%co'细胞培养箱,于48小时加入潮霉素后,显微镜下观察细胞生长和死亡情况.1,2.3空白对照取O.8ml浓度为5×1/ml的2.2.15细胞,加30~aTE(不含质粒),入37℃,5%co2细胞培养箱,于48小时加入潮霉素后,显微镜下观察细胞生长和死亡情况.2结果空白对照组:加入潮霉素后第1天,镜下5%细胞贴壁,第2天细胞全部死亡.电转染组:加入潮霉素后第1天,镜下40%细胞贴壁,第2天30%,第3天15%,第4天10%,第5天7%,第l5天时,细胞全部死亡.糖化多聚赖氨酸组:加入潮霉素后第1天,镜下30%细胞贴壁,第2天25%,第3天20%,第4天14%,第5天lO,第l5天2%,第l9天时,仍有2个细胞生长良好.把它们消化后,分别加入两孔中继续加潮霉素培养,细胞继续分裂成为2个克隆.各第4期陈枫等:重组质垃导人真核细胞的两种方法比较28l 组细胞经潮霉素筛选后存活与时间的关系见附图.枣匿羞谁霉露潮霉素筛选后时同【天附图潮霉素筛选后细胞存活与时闻的关系3讨论本研究表明,体外实验中,无论是电穿孔挂,还是糖化多聚赖氨酸导向,均能将外源基因有效地导人真核细胞,而电穿孔效率相对较高.然而,转染成功的细胞,随着时闻的推移,在相同培养条件下,第3天以后,电穿孔组死亡数量就开始比糖化多聚赖氨酸组增多;第l5天时,前者已经全部死亡,而糖化多聚赣氨酸组最终有2个细胞克隆形成,说明糖化多聚赖氨酸导向对细胞本身的不良影响可能更小. 这种影响,可能和这两种不同方法的作用原理有关. 肝细胞膜上存在一类糖蛋白受体,该受fCfr导的胞饮作用可把糖蛋白定向转运到胞内溶酶体进行代谢.我们设计的导向配体可十分简捷地与重组质粒结合,通过胞饮作用转运到2.2.15细胞中.另有研究表明,导向配体与DNA物质转运到肝细胞内,并且在活体内短时间(8小时)不被降解,而极少与肝外组织结合或根本不结厶'.电穿孔介导的基因转移,据认为是通过外加电场造成细胞膜暂时性结构改变所形成的可恢复的孔隙而进入细胞内.穿膜孔隙的形成是在外加电场诱导下,离子成分聚集在细胞膜的两侧,从而产生高强度的跨膜电势而诱发.根据上述不同原理,我们可以认为,电穿孔实际上是通过对细胞膜的电击损伤实现细胞膜通透性增加,或许还会对细胞器造成损伤,也可能对细胞的生长,存活形成负面影响.而糖化多聚赖氨酸则比较符合细胞的生物学特性,不会对细胞膜或细胞器造成损伤,细胞更容易存话.另外,从基因治疗的角度考虑,不可能用电击的方法将外源基因导人人体内.而糖化多聚赣氨酸介导的转染技术,因其分子量小,易透过胞膜,无抗原性"J,成本较低,并通过胞饮作用进入细胞,无电击损伤,更有利于临床上广泛应用.参考文献1钟森.陈枫,张建军.乙肝病毒C区反义基因真核表达载体的构建[J:泸州医学院,1997;20(3):1672.WucY,WuCHSpecificir~dbilJonofhetmlalisBvirus ex0ree,~ortinvitroby诅】antisemeoligonueleiofides[J] J.Bioehem,1992~267:124363.陈枫,钟森,王明勇,等.ttB~一前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染2215细胞转化方案的优化[J].泸州医学院,2000;2(4):2854.WuGY,WuCH.Receptor—mediatednedeliveryand一prestoninvivo[J]JBioehem,1988;263:146215郭军,周永幸,姚志强,等.半乳糖受体介导的反义硫代寡核苷酸肝细胞导向作用的体外研究[J]中华传染病杂志1997;15(1):166.TekieW AgamfianRD,ChockPB.Seleedveand口口c moleculartlamlX~ilg~ro6flelecn0pedlmembrane[JJ Proe.NailA衄dSeiUSA.1994;91:1157.钟森,张定凤,温守明,等.反义寡核苷酸靶向肝细胞体外抗己肝病毒的实验研究[J]中华医学杂志, 1995;75(7):392(2001一O1一o4收稿)泸州医学院2001年第卷第4期J~'nalofIMedicalC0l1.V o1.24No.42IE,lC0MARIs0NBETWEENTWOⅣ匝TH0DS0FDE]U[,7ERⅡGGENESDⅡDEI】l【ARyonCaEISChertFeng,otalLaboffnfec~n&Itmmmolo~,..hmMedicolCollegeHospitalAl~act0眯斌ive:Toc0rnptheadvantageO1"defectbetweenglactc6ylatedpoIy—L—tysine(Gal—PⅡ)tar—getingandetectIoporatinnfordeliveringgeneintoeukaryotic~ells.Method:Takeoptimalek 曲唧ora6∞progrmnof Gal—PlJIltargetingtodeliverrecombinantplasmidpcEP4一aCinto2.2.15cells.respectively.andthentoecnlparethe advantageoi"defectbetweenthemResult:BothmethodscoulddeliverpcEP4——aCinto2.2.t5cellseffectively.How—ever,afteracceptaIle~ofpcEP4一aC,the2.2.15cellswouddsurvivelongerwhenbyGal—PLLla臀tiJ1g.Conclusion:Gal—PLLtargetingt~andisnot0nIvabletodelivergeneintohepatocyteseffeclively.butisalsonlol ~suitableforapply—ingtoinvivouse.KeywordsRecombinantp/asmid;Electroporation;Clactosylatedpoiy—L—lysine(C.-al —m):Targeting碘伏在耻骨上前列腺摘除术中的应用邓勇,黄l泸州医学院:附属医院泌尿外科;我院1995年1月一1997年1月应用含碘浓度3000哪的碘伏(r,vP—I)纱布填塞前列腙窝止血行前列腙摘除术254例,止血效果满意,现报告如下.1临床资料本组254倒,年龄印一94岁.病程2月一3年.其中良性前列腙增生243列,前列腺癌l1倒.120例以急性尿潴留急诊人院,台并膀胱结石38例,膀胱癌13例台并高血压病,肺心病,冠心病共130侧平均手术时间65分钟,术中,术后多数不输血.2止血方法及效果均行耻骨上前列腙摘除术,切开膀胱后,看清膀胱内是否合并其他疾病,及双侧输尿管121情况.如台并膀胱癌,先切f亲J畴胱癌.于前列腙突人膀胱处切开膀胱粘膜,剜出前列腺后立即将蘸有PvP一1的纱布填满腙窝.用拉钩加压压迫5 分钟.此时,可见棕色气泡从腙窝内外溢,对膀酰粘麒无损伤取出纱布后见腺窝出血明显减少.用2—0肠线缝扎5—7点窝缘出血点,不缝台腙窝.安三腔气囊尿管,于膀胱颈12112点作1—2针磺形缝合,缩小膀胱颈,容气囊尿管和食指尖通过.气囊注水3嘶d,牵引压迫膀胱颈,使腙窝与膀胱隔离.前100侧行膀胱造瘘,以后病例再造瘘.术后用生理盐水持续冲洗膀虢,观察冲洗液转清时间.术中用碘伏珀,刘顺忠病理生理学教研室,泸州6460OO)后.腙窝出血明显减少,当天冲洗液均呈漩红色,甚至闻断出现转清现象.第三天完全转清246例.另2o例束转清与膀胱痉挛有关,经对症处理后尿液转清,无继发大出血.术后牵引时间1—2天,冲洗液IU000—20000ml,平均15~0ml.术后10天拔除尿管,除8例前列腺癌排尿不畅外,其余病侧排尿通畅.随访3个月至2年,无尿失禁,尿道狭窄,附皋炎等并发症.3讨论tWP—I全称聚乙烯吡咯烷酮碘,是碘与聚乙烯毗咯烷酮络台而成又名碘伏.该药无毒,无过敏反应,对皮肤牯膜刺激性极小是临床广泛应用的消毒剂.PVP—I有止血作用,因为PVP—I溶液中的"游离碘"碘化血液中的蛋白形成凝固的碘化蛋白.PVP—I的止血机理是收缩血管,促进凝血.实践证明碘伏用于前列腺摘除术止血效果很好,可使术中,术后出血减少到最低限度,多数不需输血和膀胱造瘘. PVP—I纱布置于前列腺窝创面后可形成一层保护膜,起到消毒,抗感染,促进创面禽合的作用,可有效地预防手术后的感染出血.当取出含碘伏的纱布后,即可见腺窝内基本无出血或很少出血,术野非常清洁.应用碘伏止血.术后牵引及冲洗时闻短,冲洗{斑用量少,病人痛苦小,恢复快,术后并发症少,是前列腺开放手术止血的好方法(2∞1一∞一20收稿)。