OtsAB途径对谷氨酸棒杆菌ATCC13032胞内海藻糖含量及细胞耐受性的影响
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
O tsAB 途径对谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032 胞内海藻糖含量及细胞耐受性的影响
陈 君, 吕扬勇, 李智涛, 郑穗平*
( 华南理工大学 生物科学与工程学院, 广东 广州 510006)
摘要: OtsAB 途径是谷氨酸棒杆菌胞内海藻糖 3条合成途径中最主要的一条. 从野生型谷氨酸
棒杆菌 ( Corynebacterium glutam icum ) ATCC 13032出发, 通过重叠延伸 PCR 及同源重组技术构
谷氨酸棒杆菌的海 藻糖合成主 要有 3 条途
第 6期
陈君等: O tsA B途径对谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032胞内海藻糖含量及细胞耐受性的影响
65
径: O tsAB 途径, 海藻糖 - 6 - 磷酸合成酶 ( treha lose- 6 - phosphate syn thase, O tsA ) 和海藻糖 - 6 - 磷酸磷酸酶 ( trehalose- 6- phosphate phospha tase O tsB )分两步催化, 由 UDP - 葡萄糖及葡萄糖 - 6- 磷酸合成海藻糖; T reYZ 途径, 由麦芽寡糖 基 海 藻 糖 合 酶 ( m altoo ligosy ltrehalose synthase, T reY )及麦芽寡糖基海藻糖水解酶 ( m altoo ligosy l trehalose treha lohydro lase, T reZ ) 分两步催化 ( 14) 葡聚糖合成海藻糖; T reS 途径, 直接由海藻糖 合成酶 ( trehalose synthase, T reS ) 转化麦芽糖得到 海藻糖. 尽管每条途径的调节机制以及各途径之 间的相互关系仍然没有明确的解释, 但 O tsAB 途 径被普遍认为是谷氨酸棒杆菌合成海藻糖的主要 途径 [ 8- 10] .
来源
实验室保存 中国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中心 本研究
本研究质粒 [ 11]
本研究 [ 12] 本研究
谷氨酸棒杆菌及大肠杆菌均用 LB 培养基培 养, 大肠杆菌培养温度为 37 , 谷氨酸棒杆菌培 养温度按条件设定. 卡那霉素浓度为 50 g /mL. IPTG 诱导 浓 度 为 0. 2 g /L, 细菌 培 养 12 h 后 加入. 1. 1. 2 酶与试剂
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌种、质粒及培养条件
实验中所用的菌种及质粒如表 1所示.
菌株和质粒 菌株
E. coli TO P10
A TCC 13032WT
C orynebacterium g lu tam i cum ( otsAB ) C orynebacterium g lu tam i cum (pEC otsAB ) pk18m obsacB 质粒 pk18- dAB pEC - XK 99E pEC - otsAB
用于获得 otsA 及 otsB 基因内双缺失的 DNA 片段, 设计重叠延伸 PCR 引物如下:
ots1: 5 CCCGAATTCATGGATGATTCCAAT AGCTTTGT 3 ;
ots2: 5 TTAAATTCAAATCGCCTGAAATAT GCCTCGAACAATCTCTT 3;
ots3: 5 ATTTCAGGCGATTTGAATTTAACTG CACTTCATCCGTGTTTC 3 ;
限制性内切酶、T 4 DNA ligase、T aq DNA Po ly m erase均为宝 生物工 程 ( 大 连 ) 有 限公 司产 品, PCR 产物纯化 及胶回收试剂 盒购自 Q IAGEN 公 司, 胰蛋白胨、酵母提取物购自 Oxo id公司; 其他 化学试剂均为国产或进口分析纯产品. 1. 1. 3 寡聚核苷酸引物
及该条件下各菌株胞内海藻糖的含量. 结果表明: 不同培养条件下, C orynebacterium glutam icum
( otsAB )胞内海藻糖含量与同条件野生型相比减少了 34. 40% ~ 44. 96% , 对于渗透压和温度
的耐受性明显降低; 在相同的培养温度 ( 30 )、不同的渗透压条件下, Corynebacterium g lutam i
第 30卷第 6期
河南工业大学学报 ( 自然科学版 )
2009年 12月
Journa l o fH enan Un iversity of T echno logy( N atural Sc ience Edition)
Vo .l 30, N o. 6 Dec. 2009
文章编号: 1673 2383( 2009) 06 0064 07
66
河南工业大学学报 ( 自然科学版 )
第 30卷
otsAB antisense: 5 GGATCTAGATTAAATC
CCCAATCGCACGCT 3 ; 其中 otsAB sense有 KpnI 酶切位点, o tsAB an
tisense有 X baI 酶切位点. 上述引物合成由深圳华 大基因研究院完成. 1. 2 方法 1. 2. 1 载体 pk18- dAB 及 pEC- otsAB 的构建
氨基酸生产菌种对高温、高渗环境的耐受性 对氨基酸生产有非常重要的意义. 研究表明, 细菌 在受到环境渗透胁迫时会合成海藻糖等渗透调节 物质以抵御不良环境条件. 同时, 海藻糖还可以保 护生物膜结构在受水分胁迫时不受损害而维持细 胞膜的正常功能, 从而提高细菌对渗透胁迫的耐 受性 [ 3- 5] .
在谷氨酸棒杆菌中, 不仅海藻糖是细胞膜双 分子层的组 成成分 ( trehalose m onocorynom yco late ( TM CM ) 和 treha lose dicorynom yco late ( TDCM ) ) [ 6] , 而且谷氨酸棒杆菌对于高渗透压的响应也会 产生大量的海藻糖 [ 7] .
国内目前大多采用诱变筛选获得的菌株进行 氨基酸的发酵生产, 由于诱变的工作量大, 盲目性 高, 而且筛选的突变株生理状态不佳或完全失调,
收稿日期: 2009 09 15 基金项目: 国家 十一五 科技支撑计划 ( 2007BAK 36B03) 作者简介: 陈君 ( 1985 ), 男, 江苏东 台人, 硕士研 究生, 研 究方向 为发酵工程. * 通讯作者
wenku.baidu.com
建了 O tsAB途径缺陷突变株 Corynebacterium glutam icum ( otsAB ); 利用谷氨酸棒杆菌穿梭表
达载体 pEC - XK99E构建重组工程菌株 Corynebacterium g lu tam icum ( pECo tsAB )过量表达同源
otsA 及 o tsB 基因. 考察了野生型、缺陷型及过量表达菌株对于不同渗透压和培养温度的耐受性
pEC - otsAB. 1. 2. 2 重组载体转化 ATCC 13032WT
ATCC 13032WT 感受态的制备及外源基因电 转化 参 考余 秉琦 等人 的方 法 [ 14] , 并 略作 修 改. pK18- dAB 转化 ATCC 13032WT 感受态后, 经两 次同源重组, PCR 方法鉴定筛选得 O tsAB 途径缺 失的 谷氨 酸 棒杆 菌 突 变株 Corynebacterium g lu tam icum ( o tsAB ). pEC o tsAB 转 化 ATCC 13032WT 感受态 后, 用含 50 g /mL 卡那 霉素的 LB平板筛选, 提质粒酶切鉴定, 得 otsAB 基因过 量表达的突变株 Corynebacterium g lutam icum ( pE
为了研究海藻 糖合成 O tsAB 合成途径 对谷 氨酸棒杆菌环境耐受性的关系, 笔者以野生型菌 株 Corynebacterium g lutam icum ATCC 13032WT 为
出发菌株, 采用重叠延伸 PCR 及同源重组技术获 得 O tsAB 途 径 缺 失 的 谷 氨 酸 棒 杆 菌 突 变 株 Corynebacterium glutam icum ( otsAB ), 另外 利 用 谷氨酸棒杆菌穿梭表达 载体 pEC - XK 99E 构建 Corynebacterium glutam icum ( pEC otsAB ) 过量 表达 同源 otsA 及 otsB 基因. 然后通过比较突变株与出 发菌株的海藻糖合成能力及在高渗高温环境下的 生长情况, 研究 O tsAB 途径对谷氨酸棒杆菌细胞 内海藻糖含量及环境耐受性的影响, 为进一步构 建良好的谷氨酸生产菌提供实验依据.
所以产量的进一步提高有一定的局限性. 随着基 因工程的发展, 应用 DNA 重组技术、基因定向诱 变技术, 可以弥补传统诱变方法的这些缺陷, 从而 综合不同菌株的优点, 改变菌株的代谢途径, 选育 出高产、优质的生产菌株. 尤其是 2003年谷氨酸 棒杆菌 标准菌 株 ATCC 13032 全 基因 序列的 完 成, 为采用基因工程及分子生物学的手段改造氨 基酸生产菌株创造了条件 [ 2] .
otsA 及 otsB 基因内双缺失的 DNA 片段 dAB 的获得, 采用重叠延伸 PCR 的方法 [ 13] . 以 ATCC 13032基因组 DNA 为模板通过普通 PCR 方法获 得 otsA 基因 5 端片段及 otsB 基因 3 端片段, 以 PCR 产物为模板通过重叠延伸 PCR 获得 otsA 及 otsB 基因内 双缺失 的 DNA 片 段 dAB. 将获 得的 dAB 片段与 基因敲除载体 pk18m obsacB 连接. 以 ATCC 13032WT 基因组 DNA 为模 板, otsAB sense、 otsAB an tisense为引 物扩 增得 到 的完 整 otsAB 基 因, 与 pEC - XK 99E 载体连接. 连接 液用热击法 分别转化到大肠杆菌 TOP10感受态细胞中, 将阳 性克隆筛选出的并且酶切鉴定正确的质粒进行测 序, 测序 正确 的质粒 分别命 名为 pk18 - dAB 和
cum ( pECotsAB )胞内海藻糖含量与野生型相比增加了 14. 53% ~ 34. 5% ; 细胞对于温度和渗透
压的耐受性随胞内海藻糖含量的增加而提高.
关键词: 谷氨酸棒杆菌; o tsAB途径; 海藻糖; 细胞耐受性
中图分类号: T S201 3
文献标识码: B
0 引言
自从 1957年 K inoshit首次描述谷氨 酸棒杆 菌 ( Corynebacterium glutam icum ) 为 谷 氨 酸 产 生 菌 [ 1] , 谷氨酸棒杆菌已经逐渐成为全世界范围内 用于氨基酸生产的主要菌株. 目前, 全世界每年利 用谷氨酸棒杆菌生产大约 100万 t L 谷氨酸用于 食品调味剂, 利用各种突变株大约生产 45万 t L 赖氨酸用作食品添加剂. 此外, 谷氨酸棒杆菌还被 用来生产 L 苯丙氨酸、L 苏氨 酸、L 色氨酸、L 精 氨酸、L 谷氨酰胺、L 丝氨酸、L 脯 氨酸及 L 异亮 氨酸等多种氨基酸.
相关特性
表 1 本研究中所用的菌种及质粒
F- , m crA ( m rr- h sd RM S - m crBC ) , 80, lacZ M 15, lacX74, re cA 1, ara 139 ( ara- leu) 7697, galU, galK, rps, ( Strr) endA 1, nupG 野生型谷氨酸棒杆菌
ATCC 13032WT w ith delet ion in the otsAB genes
otsAB + , ATCC 13032W T w ith p lam id pEC- otsAB KmR SucS, M ob ilizab le E. coli vector
C ontain ing otsAB d eletion fragm ent dAB in pk18m obsa cB KmR, E. col i- C. g lu tam icum shu ttle vector C ontain ing otsAB in pEC - XK 99E
ots4: 5 CTGCTCTAGATTAAATCCCCAATCG CACGCT 3 .
其中 ots2, ots3有 22bp互补序列 ( 在 其引物 序列中以下划线标出 ), ots1有 E coR I酶切位点, ots4有 X ba I酶切位点.
为了获得完整的 otsAB 基因, 设计引物如下: otsAB sense: 5 GCGGTACCATGGATGATTCC AATAGCTT 3;
陈 君, 吕扬勇, 李智涛, 郑穗平*
( 华南理工大学 生物科学与工程学院, 广东 广州 510006)
摘要: OtsAB 途径是谷氨酸棒杆菌胞内海藻糖 3条合成途径中最主要的一条. 从野生型谷氨酸
棒杆菌 ( Corynebacterium glutam icum ) ATCC 13032出发, 通过重叠延伸 PCR 及同源重组技术构
谷氨酸棒杆菌的海 藻糖合成主 要有 3 条途
第 6期
陈君等: O tsA B途径对谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032胞内海藻糖含量及细胞耐受性的影响
65
径: O tsAB 途径, 海藻糖 - 6 - 磷酸合成酶 ( treha lose- 6 - phosphate syn thase, O tsA ) 和海藻糖 - 6 - 磷酸磷酸酶 ( trehalose- 6- phosphate phospha tase O tsB )分两步催化, 由 UDP - 葡萄糖及葡萄糖 - 6- 磷酸合成海藻糖; T reYZ 途径, 由麦芽寡糖 基 海 藻 糖 合 酶 ( m altoo ligosy ltrehalose synthase, T reY )及麦芽寡糖基海藻糖水解酶 ( m altoo ligosy l trehalose treha lohydro lase, T reZ ) 分两步催化 ( 14) 葡聚糖合成海藻糖; T reS 途径, 直接由海藻糖 合成酶 ( trehalose synthase, T reS ) 转化麦芽糖得到 海藻糖. 尽管每条途径的调节机制以及各途径之 间的相互关系仍然没有明确的解释, 但 O tsAB 途 径被普遍认为是谷氨酸棒杆菌合成海藻糖的主要 途径 [ 8- 10] .
来源
实验室保存 中国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中心 本研究
本研究质粒 [ 11]
本研究 [ 12] 本研究
谷氨酸棒杆菌及大肠杆菌均用 LB 培养基培 养, 大肠杆菌培养温度为 37 , 谷氨酸棒杆菌培 养温度按条件设定. 卡那霉素浓度为 50 g /mL. IPTG 诱导 浓 度 为 0. 2 g /L, 细菌 培 养 12 h 后 加入. 1. 1. 2 酶与试剂
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌种、质粒及培养条件
实验中所用的菌种及质粒如表 1所示.
菌株和质粒 菌株
E. coli TO P10
A TCC 13032WT
C orynebacterium g lu tam i cum ( otsAB ) C orynebacterium g lu tam i cum (pEC otsAB ) pk18m obsacB 质粒 pk18- dAB pEC - XK 99E pEC - otsAB
用于获得 otsA 及 otsB 基因内双缺失的 DNA 片段, 设计重叠延伸 PCR 引物如下:
ots1: 5 CCCGAATTCATGGATGATTCCAAT AGCTTTGT 3 ;
ots2: 5 TTAAATTCAAATCGCCTGAAATAT GCCTCGAACAATCTCTT 3;
ots3: 5 ATTTCAGGCGATTTGAATTTAACTG CACTTCATCCGTGTTTC 3 ;
限制性内切酶、T 4 DNA ligase、T aq DNA Po ly m erase均为宝 生物工 程 ( 大 连 ) 有 限公 司产 品, PCR 产物纯化 及胶回收试剂 盒购自 Q IAGEN 公 司, 胰蛋白胨、酵母提取物购自 Oxo id公司; 其他 化学试剂均为国产或进口分析纯产品. 1. 1. 3 寡聚核苷酸引物
及该条件下各菌株胞内海藻糖的含量. 结果表明: 不同培养条件下, C orynebacterium glutam icum
( otsAB )胞内海藻糖含量与同条件野生型相比减少了 34. 40% ~ 44. 96% , 对于渗透压和温度
的耐受性明显降低; 在相同的培养温度 ( 30 )、不同的渗透压条件下, Corynebacterium g lutam i
第 30卷第 6期
河南工业大学学报 ( 自然科学版 )
2009年 12月
Journa l o fH enan Un iversity of T echno logy( N atural Sc ience Edition)
Vo .l 30, N o. 6 Dec. 2009
文章编号: 1673 2383( 2009) 06 0064 07
66
河南工业大学学报 ( 自然科学版 )
第 30卷
otsAB antisense: 5 GGATCTAGATTAAATC
CCCAATCGCACGCT 3 ; 其中 otsAB sense有 KpnI 酶切位点, o tsAB an
tisense有 X baI 酶切位点. 上述引物合成由深圳华 大基因研究院完成. 1. 2 方法 1. 2. 1 载体 pk18- dAB 及 pEC- otsAB 的构建
氨基酸生产菌种对高温、高渗环境的耐受性 对氨基酸生产有非常重要的意义. 研究表明, 细菌 在受到环境渗透胁迫时会合成海藻糖等渗透调节 物质以抵御不良环境条件. 同时, 海藻糖还可以保 护生物膜结构在受水分胁迫时不受损害而维持细 胞膜的正常功能, 从而提高细菌对渗透胁迫的耐 受性 [ 3- 5] .
在谷氨酸棒杆菌中, 不仅海藻糖是细胞膜双 分子层的组 成成分 ( trehalose m onocorynom yco late ( TM CM ) 和 treha lose dicorynom yco late ( TDCM ) ) [ 6] , 而且谷氨酸棒杆菌对于高渗透压的响应也会 产生大量的海藻糖 [ 7] .
国内目前大多采用诱变筛选获得的菌株进行 氨基酸的发酵生产, 由于诱变的工作量大, 盲目性 高, 而且筛选的突变株生理状态不佳或完全失调,
收稿日期: 2009 09 15 基金项目: 国家 十一五 科技支撑计划 ( 2007BAK 36B03) 作者简介: 陈君 ( 1985 ), 男, 江苏东 台人, 硕士研 究生, 研 究方向 为发酵工程. * 通讯作者
wenku.baidu.com
建了 O tsAB途径缺陷突变株 Corynebacterium glutam icum ( otsAB ); 利用谷氨酸棒杆菌穿梭表
达载体 pEC - XK99E构建重组工程菌株 Corynebacterium g lu tam icum ( pECo tsAB )过量表达同源
otsA 及 o tsB 基因. 考察了野生型、缺陷型及过量表达菌株对于不同渗透压和培养温度的耐受性
pEC - otsAB. 1. 2. 2 重组载体转化 ATCC 13032WT
ATCC 13032WT 感受态的制备及外源基因电 转化 参 考余 秉琦 等人 的方 法 [ 14] , 并 略作 修 改. pK18- dAB 转化 ATCC 13032WT 感受态后, 经两 次同源重组, PCR 方法鉴定筛选得 O tsAB 途径缺 失的 谷氨 酸 棒杆 菌 突 变株 Corynebacterium g lu tam icum ( o tsAB ). pEC o tsAB 转 化 ATCC 13032WT 感受态 后, 用含 50 g /mL 卡那 霉素的 LB平板筛选, 提质粒酶切鉴定, 得 otsAB 基因过 量表达的突变株 Corynebacterium g lutam icum ( pE
为了研究海藻 糖合成 O tsAB 合成途径 对谷 氨酸棒杆菌环境耐受性的关系, 笔者以野生型菌 株 Corynebacterium g lutam icum ATCC 13032WT 为
出发菌株, 采用重叠延伸 PCR 及同源重组技术获 得 O tsAB 途 径 缺 失 的 谷 氨 酸 棒 杆 菌 突 变 株 Corynebacterium glutam icum ( otsAB ), 另外 利 用 谷氨酸棒杆菌穿梭表达 载体 pEC - XK 99E 构建 Corynebacterium glutam icum ( pEC otsAB ) 过量 表达 同源 otsA 及 otsB 基因. 然后通过比较突变株与出 发菌株的海藻糖合成能力及在高渗高温环境下的 生长情况, 研究 O tsAB 途径对谷氨酸棒杆菌细胞 内海藻糖含量及环境耐受性的影响, 为进一步构 建良好的谷氨酸生产菌提供实验依据.
所以产量的进一步提高有一定的局限性. 随着基 因工程的发展, 应用 DNA 重组技术、基因定向诱 变技术, 可以弥补传统诱变方法的这些缺陷, 从而 综合不同菌株的优点, 改变菌株的代谢途径, 选育 出高产、优质的生产菌株. 尤其是 2003年谷氨酸 棒杆菌 标准菌 株 ATCC 13032 全 基因 序列的 完 成, 为采用基因工程及分子生物学的手段改造氨 基酸生产菌株创造了条件 [ 2] .
otsA 及 otsB 基因内双缺失的 DNA 片段 dAB 的获得, 采用重叠延伸 PCR 的方法 [ 13] . 以 ATCC 13032基因组 DNA 为模板通过普通 PCR 方法获 得 otsA 基因 5 端片段及 otsB 基因 3 端片段, 以 PCR 产物为模板通过重叠延伸 PCR 获得 otsA 及 otsB 基因内 双缺失 的 DNA 片 段 dAB. 将获 得的 dAB 片段与 基因敲除载体 pk18m obsacB 连接. 以 ATCC 13032WT 基因组 DNA 为模 板, otsAB sense、 otsAB an tisense为引 物扩 增得 到 的完 整 otsAB 基 因, 与 pEC - XK 99E 载体连接. 连接 液用热击法 分别转化到大肠杆菌 TOP10感受态细胞中, 将阳 性克隆筛选出的并且酶切鉴定正确的质粒进行测 序, 测序 正确 的质粒 分别命 名为 pk18 - dAB 和
cum ( pECotsAB )胞内海藻糖含量与野生型相比增加了 14. 53% ~ 34. 5% ; 细胞对于温度和渗透
压的耐受性随胞内海藻糖含量的增加而提高.
关键词: 谷氨酸棒杆菌; o tsAB途径; 海藻糖; 细胞耐受性
中图分类号: T S201 3
文献标识码: B
0 引言
自从 1957年 K inoshit首次描述谷氨 酸棒杆 菌 ( Corynebacterium glutam icum ) 为 谷 氨 酸 产 生 菌 [ 1] , 谷氨酸棒杆菌已经逐渐成为全世界范围内 用于氨基酸生产的主要菌株. 目前, 全世界每年利 用谷氨酸棒杆菌生产大约 100万 t L 谷氨酸用于 食品调味剂, 利用各种突变株大约生产 45万 t L 赖氨酸用作食品添加剂. 此外, 谷氨酸棒杆菌还被 用来生产 L 苯丙氨酸、L 苏氨 酸、L 色氨酸、L 精 氨酸、L 谷氨酰胺、L 丝氨酸、L 脯 氨酸及 L 异亮 氨酸等多种氨基酸.
相关特性
表 1 本研究中所用的菌种及质粒
F- , m crA ( m rr- h sd RM S - m crBC ) , 80, lacZ M 15, lacX74, re cA 1, ara 139 ( ara- leu) 7697, galU, galK, rps, ( Strr) endA 1, nupG 野生型谷氨酸棒杆菌
ATCC 13032WT w ith delet ion in the otsAB genes
otsAB + , ATCC 13032W T w ith p lam id pEC- otsAB KmR SucS, M ob ilizab le E. coli vector
C ontain ing otsAB d eletion fragm ent dAB in pk18m obsa cB KmR, E. col i- C. g lu tam icum shu ttle vector C ontain ing otsAB in pEC - XK 99E
ots4: 5 CTGCTCTAGATTAAATCCCCAATCG CACGCT 3 .
其中 ots2, ots3有 22bp互补序列 ( 在 其引物 序列中以下划线标出 ), ots1有 E coR I酶切位点, ots4有 X ba I酶切位点.
为了获得完整的 otsAB 基因, 设计引物如下: otsAB sense: 5 GCGGTACCATGGATGATTCC AATAGCTT 3;