细菌菌落总数的测定(精)

倒入适温培养基（50℃左右，冷却到不烫手为宜），每皿培养基倒入 量一般9cm培养皿15ml左右（培养皿平放时倒入一半至2/3面积左右）；
混匀（倒培养基时培养皿适度倾斜，桌面适度旋转，但不得使培养基 附着到培养皿侧面）；
静置冷却成平板，翻转放置。
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2.2 平板涂布法 先制作平板； 取样品（无菌水）0.1ml放入平板
对于不利于细菌生长的污染物，常需检测对应专门微生物及污染 物含量的直接检测。
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二、稀释平板培养计数法
细菌的个体微小，直接观察、计数困难； 单个细菌经过培养可长成肉眼可见的菌落； 要设法避免多个细菌长成1个菌落，常需对 样品进行稀释处理。
细菌菌落总数的测定 稀释平板培养菌落
净 化 工 作 台
细菌菌落总数的测定
酒精灯无菌区操作
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细菌菌落总数的测定
（3） 无菌操作规范
试管、锥形瓶等无菌用具在无菌区打开，在此范围外必需 封闭（基本原则），在无菌区外污染后不得再次使用；
接种工具、涂抹棒等灭菌后即时在无菌区使用，区外污染 后需再灭菌使用（注意灭菌后需在无菌区冷却后使用，以免烫 死微生物而取不到到活的微生物）。
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细菌菌落总数的测定
一、细菌总数是水质污染的重要指标
细菌数量与污染程度间具有相关性。水体污染主要涉及生活污水、 人畜粪便、农业生产污染、工业污染等，污染物质中除去部分工业污 染物外大多利于细菌的生长。
污染物质的直接检测有较大的困难，而细菌检测相对容易，因此 常用细菌数量作为水质状况的主要指标之一。
不同稀释度不得使用同一移液管，防止交叉影响及污染；
平板涂布法中，最好先在净化工作台中提前制作平板，并放置一段时 间（2d左右），以使表面稍干燥便于涂布。
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3.培养
细菌菌落总数的测定
培养温度为36℃，培养时间24h； 选用普通电热恒温培养箱，也可选用生化培养箱或霉菌培养箱； 平板培养基一面朝上，不可颠倒； 根据培养时间要求及时取出进行后续处理。
上，涂抹棒均匀涂抹平板表面，直至 无残存样品（无菌水）；
翻转放置。
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平板涂布
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细菌菌落总数的测定
2. 3注意事项
保证无菌操作要求，同时注意不得影响样品中的微生物（培养基不得 太烫，取样时不要离火焰太近）；
制作平板时培养基不得沾附底面之外的侧面甚至盖上，未凝固前不得 翻转；
培养
平板是否倒置、培养条件控制
计数与报告
计数、报告方法是否正确
分值
15 15 20 15 15 10 10
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谢谢！
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1.测定的程序：
样品稀释 接种平板 培养 菌落计数 报告
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2.材料准备：
培养皿、试管、移液管、锥形瓶等玻璃器皿的灭菌；
制作营养琼脂培养基：
蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g，水 1000mL；pH7.4~7.6，121℃灭菌15min。
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水处理微生物
知识点 细菌菌落总数的测定
周小林 副教授
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教学内容
1.细菌总数是水质污染的重要指标； 2.稀释平板培养法； 3.检测各环节操作规范。
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细菌菌落总数的测定
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四、任务考核
细菌菌落总数的测定
考核内容
考核指标
总体操作程序
是否清楚、规范
材料准备及器皿标记 材料准备种类、数量，培养皿、试管的标记
无菌操作规范
是否在无菌操作区操作、可能污染等不规范操作
稀释
取液量的准备、加样顺序、是否混匀等
平板制作
培养皿打开规范、是否混匀、平板质量等
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2. 不同稀释度的 选择与报告
细菌菌落总数的测定
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细菌菌落总数的测定
3. 报告方式
菌落数在100以内，按实际数据报告； 大于100时，采用2位有效数字，在有效数字后的位数，以四舍五 入方法计算； 数值较大时，数字后可用10的指数表示。
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2. 梯次稀释
取混匀水样1ml放入标记10－1试管中， 充分振荡混匀，得10－1稀释液；
取10－1稀释液1ml放入标记10－2试管 中，充分振荡混匀，得10－2稀释液；
……，依次稀释到所需稀释浓度。
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3. 注意事项
取液量保证准确； 稀释样要充分混匀； 保证无菌操作（防止外源污染），但加样时注意 不要太近火焰（杀死其中微生物）。
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混匀器
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四、接种培养
1.培养数量
不稀释样：样品、无菌水（无菌对照），共2 个培养，每个培养需培养3个平板（重复）；
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五、菌落计数与报告
细菌菌落总数的测定
1. 菌落计数方法
观察方法：直接肉眼观察计数，必要时用放大镜、菌落计数仪观察， 防止遗漏。
特殊情况的处理：
若某平板有较大片状菌落生长且超过一半面积时，此平板则不宜作 计数用；
片状菌落小于一半面积，且其余菌落分布又很均匀时，可取平板一 半面积计菌落数，再乘以2得本平板菌落数。
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三、样品的稀释
细菌菌落总数的测定
主要针对样品中含较多微生物的水样（水源水、污水）； 自来水、饮用水一般不需稀释，可直接取样培养。
1. 分装无菌水
取数支无菌试管，标记10－1、10－2、……,每试管分装9ml无菌水 或无菌生理盐水。
（也可分装好后再灭菌）
稀释所需的数量级根据样品中微生物量的估计而定，一般轻度 污染水稀释到10－3，重度污染水可稀释到10－5、10－6。
制备无菌水。
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3.无菌操作
（1） 保证除样品外所有需使用的材料无菌
（2） 无菌操作环境
净化工作台：紫外灯提前开放0.5h以上，放入 样品与材料需70%酒精表面消毒
开放空间：减小空气流通（闭窗、减少人员走 动等）；喷洒70%酒精净化空间；在酒精灯火焰上 方无菌区操作（高度以不烫手为宜）
教学目标
（1）知识目标
• 水质污染与细菌总数的关系； • 平板培养计数原理； • 样品稀释的方法； • 平板制作与培养方法 • 计数与报告方式。
（2）技能目标
• 掌握样品稀释的操作方法； • 熟练进行无菌操作； • 规范制作平板； • 能正确控制培养条件； • 能正确计数与报告。
（3）素质态度要求
态度端正，积极主动学习，严守操作规范，团结协作。
需稀释样：最大稀释样及前两个稀释样、无 菌水，共4个培养，每个培养需培养3个平板 （重复）；
预先在培养皿底面标记清楚培养稀释度、操 作人、时间等信息。
细菌菌落总数的测定
培养皿标记
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细菌菌落总数的测定
2. 接种平板
2.1 混合平板法
取各稀释样（无菌水）1ml放入无菌培养皿中，3个重复（可在稀释的 操作同时取）；