氨基酸的纸层析法

实验目的】通过氨基酸的分离1. 学习氨基酸纸层析法的基本原理2. 掌握氨基酸纸层析的操作技术

【实验原理】纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，纸层析所用展层溶剂大多由有机溶剂和水组成。其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。因为滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，溶剂由下向上移动的称上行法；由上向下移动的称下行法。这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，即不同的氨基酸在相同的溶剂中溶解度不同, 所以利用在滤纸上迁移速度不同分离氨基酸不同，氨基酸随流动相移动的速率就不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上而形成距原点距离不等的层析点。。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：即原点到层析点中心的距离/原点到溶液前沿的距离

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。在一定条件下，某种物质的Rf值是常数。

本实验采用纸层析法分离氨基酸。氨基酸是无色的，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。

【器材与试剂】

1．氨基酸溶液：赖氨酸(lys) 缬氨酸(val) 脯氨酸(pho) 混合氨基酸；各5mL 2．层析缸3．层析滤纸（新华1号）4．毛细管5．吹风机6．烘箱7．喷雾器8．刻度尺9．铅笔10．表面皿11．培养皿12．展层剂（扩展剂）：水合正丁醇:醋酸=4:1，即将20 mL正丁醇和5 mL冰醋酸放人分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约10mL置于小烧杯中做平衡溶剂，扩展剂20ml，13．显色剂：50～lOOmL0．1％水合茚三酮正丁醇溶液。即 0.5g茚三酮溶于100ml正丁醇，即得0.5％茚三酮一正丁醇溶液，贮于棕色瓶中备用。

【实验步骤】

1．将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。

2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。

3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点

在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。

4．扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm)。待溶剂上升15―20 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

5．显色 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。

6．计算各种氨基酸的Rf值。

【结果分析】

【复习思考作业题】

1、纸层析法的原理是什么？

2、何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？

3、怎样制备扩展剂?
4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么?

【实施情况及教学效果分析】

1、描述纸层析的原理、特点以及为什么它能让不同的物质移动的距离不同，怎么用眼睛看到不同氨基酸的位置——用茚三酮显色。引导学生讨论层析的影响因素以及本实验所要注意的事项。

2、学生理解并掌握纸层析原理及操作方法。

3、氨基酸纸层析为什么会出现拖尾现象

究其原因，经自己多次亲手操作，多次反复对比，始悟出一些道理，叙述如下：拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不是如标准图谱所示的那样，完整地显示在某一位置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。其图象的出现，原认为是在实验中，对影响Rf值的主要因素要求，掌握不够所致。诸如，物质结构与极性对Rf值的影响，层析溶剂对Rf值的影响，PH对Rf值的影响(溶剂、滤纸和样品的PH值)，温度对Rf值的影响，滤纸的质地是否均匀，薄厚是否适当，纤维的松紧度是否适中等对Rf值的影响，展层的方式(上行、下行)对Rf值的影响。然而在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出现拖尾现象。此时，这就需要从具体操作规范方面，诸如样品的处理，点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索，经仔细分析，样品的处理是为除去杂质纯化样品，达到层析分配某氨基酸的情晰显色图像；展层过程是在上述影响Rf值的主要因素要求下进行，使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图象上，区分不同样品的氨基酸；显色是在用配制好的，与水不相混合，并挥发性较快的显色剂喷雾后迅速吹干的。更何况显色剂又是含水量极低，不会影响样品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序

上了。点样是将被层析分配的几种氨基酸混合液，和为了对照实验结果，而分别配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，或血球计数器将5一15微升的样品，点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。点样后要自然风干，或冷风吹干。最好不要用加热装置，如吹风机，灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。因为加热装置在学生操作时，一但注意不够，掌握不好，则温度升高势必要使样品破坏，更会使样品点干的太干燥。正是由于这样，样品点太干燥，使其样品物的分子，牢固地吸牢在层析纸的纤维上。所以在展层过程中，样品点的每个物质分子，不能在层析纸上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，最终使洋品物质的分子，不能同时都集中到达一个位置。致使在显色后，实验结果的图象上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的拖尾现象。 因此，我认为纸上分配层析所出现的拖尾现象，究其原因很简单，就是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。原因太简单了，往往被人们容易忽略，更引不起人们的重视。但它确实在困扰着人们的实验效果。为此，建议应在该实验的点样操作中，加上一句，“样品点不要砍的太干燥，否则，样品物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上，出现拖尾现象”。