其他病原微生物分离及鉴定.ppt

（六）、血清学方法鉴定



生长抑制试验（GI） 代谢抑制试验（MI） 免疫荧光抗体（IF） 直接凝集试验 间接凝集试验 补体结合试验（CF） 双向免疫扩散试验（DID）
四、衣原体（Chlamydia）
衣原体是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生
物，介于立克次体和病毒之间，可引起人和家 畜的衣原体病。
（三）、分离培养
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ

螺旋体能够在人工培养基上生长，但需用液体 或半固体培养基。最常用的培养基有柯氏培养 基和捷氏培养基。 接种材料为血、尿及组织乳剂。 一般培养时间10-30d,确认无钩端螺旋体生长 者可弃去而判为阴性。
（四）、动物感染实验

采用幼龄豚鼠（体重150-200g）或仓鼠，腹腔 注射被检样1-3mL。接种后每日测温观察两次。



1.鸡胚卵黄囊接种 未喂过抗生素的鸡群。 2.小鼠接种 腹腔接种：3-5周龄小鼠。 鼻内接种 3.细胞培养
（四）、衣原体的分类与鉴定




1.在细菌培养基上不能生长。 2.在感染细胞的细胞质内可查见衣原体原生小体和始 体，感染细胞破裂后衣原体释放于细胞外。 3.碘染色反应：沙眼衣原体为阳性，鹦鹉衣原体为阴 性。 4.在鸡胚暖黄囊内生长，鹦鹉衣原体不为磺胺嘧啶钠 抑制，沙眼衣原体可被磺胺嘧啶钠抑制。 5.用补体结合试验检查衣原体的耐热类属共同抗原。
（一）主要生物学特性
1.形态：螺旋状 ，有些可通过细菌滤器或滤膜。 2.结构：原生质柱 、轴鞭毛 、外鞘。 3.运动性：运动活跃。 4.繁殖方式：以二分裂法繁殖。 5.核酸：核酸兼有RNA和DNA。 6.染色：革兰氏阴性，但大多数不易着色。 7.培养特性：多数需厌氧培养，营养要求较高， 有些不能用人工培养基培养。
（五）、血清学试验

一般采用已知抗原检查动物血清中的抗体。 凝集溶解试验具有高度的型特异性，是诊断本 病最常用的方法。
凝集反应（agglutination test）


一种血清学反应。颗粒性抗原（完整的病原微生物或 红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件 下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。参与 凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。可分 为直接凝集反应和间接凝集反应两类。 直接凝集反应 颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相 应抗体直接结合所出现的凝集现象。分为玻片法和试 管法。 间按凝集反应 将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种 与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后 与相应抗体（或抗原）作用。在有电介质存在的适宜 条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。

支原体的大小为0.2～0.3um,可通过滤菌器，常给细胞培养工作带 来污染的麻烦。无细胞壁，不能维持固定的形态而呈现多形性。革 兰氏染色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。细胞 膜中胆固醇含量较多，约占36%，对保持细胞膜的完整性具有一定 作用。凡能作用于胆固醇的物质（如二性霉素B、皂素等）均可引 起支原体膜的破坏而使支原体死亡。
免疫性
疾病后可获得抗同型钩体的持久免疫力。
（二）、病料的采集与检查


1.材料准备 发病早期已采取家畜的血液为宜，显微镜检查 和分离培养时，则应加抗凝剂；做血清检查时 则不加抗凝剂。发病后期肾脏中的病原体大量 增加，宜采取尿液。 2.暗视野显微镜检查 3.标本染色镜检 吉姆萨染色或方氏镀银法和钩端螺旋体媒染法 较好。
一、螺旋体
（Spirochaeta）


螺旋体是一类菌体细长、柔软、弯曲呈螺旋状、能活泼运 动的原核单细胞微生物。它的基本结构与细菌类似，有细 胞壁、核质，以二分裂繁殖，广义上属于细菌。 抵抗力－极弱。对温度和干燥特别敏感。 对常用化学消毒剂亦敏感，1%~2%石炭酸内数分钟就死亡。

对青霉素、四环素、红霉素或砷剂均敏感。


（三）、培养方法



1.培养基中培养 好气性培养 厌气性培养 2.鸡胚接种 3.动物接种
（四）、菌落形态和染色观察

菌落形态检查是分离检查支原体的第一步。然 后用Dienes法染色。
（五）、生物化学鉴定方法



1.对毛地黄皂苷的敏感性试验 2.发酵葡萄糖和水解精氨酸试验 3.水解尿素试验 4.四氮唑还原试验 5.菌落吸附红细胞试验
立克次体是一类介于病毒与细菌之间的原核细胞
型微生物，在形态结构和繁殖方式等特性上与 细菌相似，而在生长要求上又酷似病毒。此类 微生物引起人和动物立克次体病（如Q热、斑 疹伤寒、恙虫病等）。为纪念Howard Taylor
Ricketts而命名。
（一）、生物学特性
1. 多形性，主要是球杆状。 2.大小介于细菌和病毒之间，多数不能通过细菌滤器。 3.革兰氏阴性，有细胞壁 4.专性细胞内寄生 5.以二分裂方式繁殖 6.对理化因素抵抗力不强， 尤对热敏感 7.主要寄生于节肢动物中， 通过叮咬感染人和动物

营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入 10～20%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最 适pH7.8～8.0之间，低于7.0则死亡，但解脲脲原体最适 pH6.0～6.5。 大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入 5%CO2生长更好。生长缓慢，在琼脂含量较少的固体 培养基上孵育2～3天出现典型的“荷包蛋样”菌落：圆 形（直径10～16um），核心部分较厚，向下长入培养 基，周边为一层薄的透明颗粒区。此外，支原体还能在 鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长。 繁殖方式多样，主要为二分裂繁殖，还有断裂、分 枝、出芽等方式，盖因缺乏细胞壁造成分裂时二个子细 胞大小均所致。同时，支原体分裂和其DNA复制不同步， 可形成多核长丝体。
二、致病性与免疫性
致病物质---类似细菌内毒素与外毒素

二、致病性与免疫性 1．内毒素样物质(ELS)或称脂
多糖样物质(LLS)
2．溶血素
二、致病性与免疫性
3．细胞毒性因子(CTF) 4.细胞致病作用(CPE)物质
所致疾病


钩端螺旋体病------一种人畜共患传染病 传染源：鼠和猪 传播途径：经粘膜或破损皮肤进入; 经胎盘垂直传播 临床表现：先形成钩体血症；进入损伤全身毛细血管 内皮细胞，及肝、肾、肺心及中枢神经，可出现休克、 DIC、黄疸、出血、心肾功能不全、脑膜炎等。 疾病特点：起病急、高热、乏力、全身酸痛、眼结膜 充血、腓肠肌压痛、表浅淋巴结肿大。
（一）、生物学特点



１．革兰氏阴性，圆形或椭圆形 ２．含DNA和RNA两种核酸 ３．有由粘肽组成的细胞壁 ４．细胞内寄生（鸡胚或细胞培养、动物接种） ５．独特的发育周期，并以二分裂方式繁殖 ６．对某些抗生素敏感
（二）、材料


血液 液体或分泌物 粪便 组织
（三）、接种培养方法

支原体基因组为一环状以双链DNA，分子量小（仅有大肠杆菌 的五分之一），合成与代谢很有限。
肺炎支原体的一端有一种特殊的末端结构（terminal structure），能使支原体粘附于呼吸道粘膜上皮细胞表面，与致病 性有关。

（一）、病料采集和保存

一般用灭菌棉花拭子涂抹动物的粘膜表面取样。
（二）培养特性
（四）、立克次氏体的鉴定

1.形态学鉴定 2.血清学鉴定 免疫荧光染色法、补体结合 试验以及微量凝集实验。
三、支原体

支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目 前发现的最小的最简单的原核生物。支原体细 胞中唯一可见的细胞器是核糖体（支原体是原 核细胞，原核细胞的细胞器只有核糖体）。
形态与结构
（二）、病料的采集与检查


根据所怀疑的疾病或检疫要求，采取立克次氏 体含量较多、无杂菌污染或污染较少的适宜材 料，并按无菌方法采取。病料应置于-70℃保 存及时检查。 根据需要取不同形式材料。 对原始材料进行涂片染色镜检。形态学检测。
（三）、分离培养




立克次氏体的分离方法有动物或鸡胚接种、细 胞培养等。 1.动物接种 选用易感性较高的实验动物。一 般采用腹腔接种。 2.鸡胚接种 只感染动物的立克次氏体，不能 在鸡胚中培养。 3.细胞培养 多用单层细胞培养法。
沉淀反应（precipitation）


一种血清学反应。可溶性抗原与相应抗体结合， 在有适量电介质存在下，经过一定时间，形成 肉眼可见的沉淀物。沉淀反应的抗原可以是多 糖、蛋白质、类脂等。 沉淀反应的实验方法大体可分为环状法、絮状 法、琼脂扩散法三种基本类型。
二、立克次氏体（Rickettsia）