农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传再生体系研究_朱小彬

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安徽农业科学
2013 年
菌，挑取单菌落放在含 50 mg / L 利福平和 50 mg / L 氯霉素的 LB 培养液中扩增至 OD 值为 0． 5 ～ 0． 7，用 MS 液（ 加入 40 mg / L 乙酰丁香酮 AS） 重悬。下胚轴经预培养后放入侵染液 中侵染，共培养（ 暗培养） 后基本进入筛选分化阶段，3 ～ 4 周 后切取再生绿芽至培养罐，待成形后可移至生根培养基，4 ～ 5 周根系发达移至小花盆长成植株。 1． 2． 3 培 养 条 件。基 本 培 养 基 为 MS 培 养 基，3% 蔗 糖， 0． 8% 琼脂（ 或者 2． 75 g / L 植物凝胶） ，pH = 5． 8，25 ℃ ，光照 强度 200 μmol / m2 ·s，光照 14 h。 1． 2． 4 阳性苗的鉴定。DNA 水平的 PCＲ 鉴定： CTAB 法提 取植物总基因组 DNA，利用标记基因 GUS 设计引物，约 260 bp 长度； ＲNA 水平的 qPCＲ 鉴定： 用植物总 ＲNA 试剂盒提取 总 ＲNA，设计 ＲGS 干扰片段定量 PCＲ 引物（ 表 1） 。采用 2 步法标准程序进行 PCＲ 程序： 即 95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s，40 次 循环。根据扩增曲线即可确定 Ct 值（ threshold cycle，循环域 值，即产生可被探测到的 FAM 信号所需要的最少循环数） 。 以 BnＲGS1 / ACTIN 拷贝数来计算 BnＲGS1 表达水平，然后以 对照表达量为 1，计算样本的相对表达量。 1． 2． 5 发芽率、出苗率与阳性率的计算。发芽率（ % ） = 种 子发芽个数 / 播种总种子数 × 100； 出苗率（ % ） = 分化成苗的
农杆菌介导法是油菜遗传转化的主要方法［12］，原理主 要是农杆菌能够通过外植体的伤口将其携带的 DNA 整合到 植物的基因组中，并且在植物体内表达，故农杆菌可以作为 天然的载体系统广泛应用于植物转基因中。
甘蓝型油菜 再 生 体 系 的 建 立 中，已 经 从 甘 蓝 型 油 菜 中 茎、子叶和下胚轴等不同的外植体诱导出了再生植株，下胚 轴作为外植体具有再生周期短、再生效率高且操作程序简单 等优点，目 前 被 广 泛 应 用 为 甘 蓝 型 油 菜 再 生 体 系 的 外 植 体［13］。但相比较于番茄等植物，甘蓝型油菜转基因遗传转 化效率较低，限制了转基因技术的普遍利用，影响了油菜育 种水平的提高和新基因功能快速分析鉴定［14］。其中，影响 转化效率的因素有很多。笔者在前人研究的基础上，拟研究
外植体数 / 接种的外植体数 × 100； 阳性率（ % ） = 阳性再生 苗 / 总的再生苗 × 100。
表 1 PCＲ 引物
编号 1 2 3 4
基因名称 BnＲGS1
β-actin
引物序列 5' TGATAGCGGTTTGTTGTTT 3' 5' CGTTTCTCCAGCGTAGC 3' 5' TCTTCCTCACGCTATCCTCCG 3' 5' AGCCGTCTCCAGCTCTTGC 3'
摘要 ［目的］研究农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传再生体系。［方法］以甘蓝型油菜为试验材料，以组织培养为基础，以下胚轴为 外植体，以统计出愈率和出苗率为指标，探讨农杆菌介导的遗传再生苗形成的影响因素。以 G 蛋白信号转导调节蛋白（ ＲGS） 为例，建立 稳定的甘蓝型油菜下胚轴遗传再生体系。［结果］种子经 10% NaClO 灭菌 20 mim 后播种，基底用 1 /2MS 配琼脂，直径 6 cm 的培养罐 50 粒，光照充足（ 200 μmol / m2 ·s） ，成功获得 ＲGSi 干扰表达阳性株系。［结论］试验以下胚轴为外植体，系统研究了甘蓝型油菜组织培养 过程中各种因素对再生苗形成的影响，建立了有效的下胚轴遗传再生体系。 关键词 甘蓝型油菜； 组织培养； 下胚轴； 再生苗 中图分类号 S 188 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2013） 31 － 12257 － 05
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.31.053
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41（ 31） ： 12257 － 12261
பைடு நூலகம்
责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲
农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传再生体系研究
朱小彬，于一帆，葛会敏，梁建生，陈 云* （ 扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 225009）
油菜（ Brassica napus） 是仅次于大豆的第 2 大植物油脂 来源，我国为世界油菜主产国，占据世界重要地位，面积、产 量均居世界第一。专家们长期努力的目标集中在油菜的育 种和品种改良方面，常规的方法是有性杂交，但是存在着选育 年限过长、远缘杂交不亲和和亲本材料匮乏等一系列问题。后 来生物技术不断发展，直接将外源基因导入油菜来改变其生物 性状的方法已成为现今油菜育种和品种改良的热点。
基金项目 作者简介
收稿日期
国家自然科学基金项目（ 30970243） 。 朱小彬（ 1989 － ） ，女，安徽巢湖人，硕士研究生，研究方向： 植物细胞蛋白信号转导。* 通讯作者。 2013-09-02
讨论农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化过程中的可能问题 以及通过相应的单因子试验对比来优化转化过程，以期为完 善油菜兼具稳定性和可重复性的良好遗传再生体系提供一 些参考和方向，并为运用基因工程技术改良油菜奠定基础。 1 材料与方法 1． 1 材料 1． 1． 1 研究对象。甘蓝型油菜“扬油 6 号”，由扬州里下河 研究所提供。 1． 1． 2 主要试剂。头孢霉素（ Cefotaxime，sodium salt，Cef） 、 氯霉 素 （ Chloramphenicol，Chl） 、利 福 平 （ rifampicin，Ｒif） 、6BA、2，4-D、乙酰丁香酮（ Hydroxyacetophenome，AS） 和萘乙酸 （ 1-naphthylacetic acid，NAA） ，均购自 Sigma 公司； 卡那霉素 （ Kanamycin Sulfate，Kan） ，购自生工生物公司； ＲNA 提取试 剂盒，购自 TianGen 公司； ＲevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，购 自 Fermentas 公 司； SYBＲ Green supermix、Microseal Film 及 PCＲ 板，均购自 BioＲad 公司。 1． 1． 3 质 粒 和 菌 种。农 杆 菌 （ Agrobacterium tumefaciens） EHA105 菌株，表达载体为 pGSA1285 和重组质粒含有 ＲGS 干扰片段（ ＲGSi） ，均由实验室留存。 1． 2 方法 1． 2． 1 培养基的制备。MS（ Murashige ＆ Skoog，1962） ； 预培 养基（ B0 ） MS + 1 mg / L 2，4-D + 1 mg / L 6-BA； 共培养基（ B1 ） MS + 0． 1 mg / L 2，4-D + 1 mg / L 6-BA + 5 mg / L AgNO3 ； 迟筛 选培养基（ B2 pre） B1 + 500 mg / L Cef； 筛选培养基（ B2 ） B2 pre + 10 mg / L Kan； 生根培养基（ B3 ） MS + 500 mg / L Cef + 0． 3 mg / L NAA。 1． 2． 2 培养。挑 选 饱 满 健 康 的 种 子，经 表 面 消 毒 后 置 于 1 /2MS培养基上在光照培养箱中生长 5 ～ 7 d，切苗取下胚轴 作为转化受体。划线培养含有 ＲGS 干扰片段质粒的农杆
2 结果与分析 2． 1 种子消毒 成熟的种子用浓度 75% 的酒精表面消毒 1 min，再用 10% 次氯酸钠洗 20 min，用无菌水清洗 3 遍后放 在滤纸上晾干。灭菌后的种子可以直接播种，也可放入无菌 罐中待用。此过程中次氯酸钠的浓度和灭菌时间直接影响 种子的发芽率和染菌率，5% 次氯酸钠可致种子灭菌不彻底 而污染，60% 次氯酸钠洗 20 min 后可导致种子发芽率几乎为 0（ 图 1A） ，采用较高浓度的次氯酸钠灭菌同时适当减少灭菌 时间可以有效地提高发芽率和降低染菌率。杜燕等曾对贮 存过期油菜种子进行消毒处理研究，认为以 10% NaClO 处 理较好［15］，与试验结果基本一致； 但在处理时间上，以处理 20 min 比较合适（ 图 1B） 。
Studies on Agrobacterium-mediated Hypocotyle Ｒegenerative System in Brassica napus ZHU Xiao-bin et al （ College of Bioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009） Abstract ［Objective］ To study Agrobacterium-mediated hypocotyle regenerative system in Brassica napus． ［Method］With Brassica napus as test material，tissue culture as basis，hypocotyle as explant，callus induction rate and emergence rate as indexes，the influencing factors of Agrobacterium-mediated genetic regeneration seedlings were discussed． With the interfered gene of the regulators of G protein signaling （ ＲGS proteins） as example，the stable regenerative system in Brassica napus was established． ［Ｒesult］Sowing after 10% NaClO sterilization for 20 min，1 /2MS mixed with agar as basement，diameter 6 cm culture tank 50，adequate illumination （ 200 μmol / m2 ·s） ，ＲGSi interference positive strains was successfully obtained． ［Conclusion］ With hypocotyle as explants，effects of various factors on regenerative seedlings were studied in tissue culture of Brassica napus，the effective hypocotyle regenerative system was established． Key words Brassica napus； Tissue culture； Hypocotyle； Ｒegenerative seedling
注： A： 不同浓度 NaClO 处理； B： 10% NaClO 处理不同时间。 图 1 NaClO 处理对种子发芽的影响
2． 2 播种 灭菌后的种子播种于 1 /2MS 培养基，每培养罐 轴的颜色偏白，比正常下胚轴长度长，叶子偏小。黄化下胚 （ 直径 6 cm） 播种 50 粒。过高的播种密度会导致油菜下胚轴 轴由于本身比较脆弱，在预培养的时候末端膨大率偏低，且 长短粗细 不 一，长 势 不 均 匀 （ 图 2A） ； 当 光 照 不 足 （ ＜ 100 会发生不同程度腐烂现象（ 图 2C） ，导致无法进行侵染。 μmol / m2 ·s） 时会导致黄化下胚轴的产生（ 图 2B） ，黄化下胚 2 ． 3 外植体 以下胚轴作为甘蓝型油菜再生体系的外植
目前，油菜转基因的方法主要有： 农杆菌介 导 法［1 －4］、 PEG 法［5 － 6］、电击法［7 － 8］、微注射法［9 － 10］和基因枪法和子房 注射法［11］。其中农杆菌介导法具有费用低、操作简单、稳定 性好、效率高、宿主范围广、插入外源基因片段大和转基因拷 贝数低等优点，所以成为了转基因策略中的首选方法。