酶工程 酶改性的基本理论——酶的结构及其与催化特性的关系

C—C、 N — C，真正单键（pure single bond），可以旋转
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二硫键：2个Cys的巯基脱氢联结而成
肽链内二硫键
肽链间二硫键
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牛胰核糖核酸 酶一级结构
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胰凝乳蛋白酶 chymotrypsin
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酶蛋白化学结构的测定
（1）酶蛋白的分离纯化（纯度＞97％） 沉淀、离心、电泳、层析等等 （2）氨基酸种类和数目的确定 蛋白质水解后用层析技术等分离鉴定。氨基酸自动分析仪
大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)
聚合酶克隆（Polony Sequencing） 454焦磷酸测序（454 pyrosequencing） Illumina (Solexa) sequencing ABI SOLiD sequencing 离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing） DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。
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第五章 酶改性的基本理论
——酶的结构及其与催化特性的关系 第一节 酶的化学组成 第二节 酶的化学结构 第三节 酶的空间结构 第四节 酶的活性中心 第五节 酶的结构与催化特性的关系
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第一节 酶的化学组成
蛋白类酶 蛋白质 酶
核酸类酶 RNA
酶蛋白 酶RAN
氨基酸（20种） 核苷酸（4种）
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一、蛋白类酶的基本组成单位——氨基酸
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(6)鸟苷 鸟苷是含Ⅰ型IVS的自我剪接酶(R-酶)的辅助因子。 (7) 辅酶Q 辅酶Q是一系列苯醌衍生物 一些氧化还原酶的辅助因子。 (8) 谷胱甘肽(GSH) L-Glu—L-Ile—L-Gly三肽
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(9) 辅酶A （CoA） 辅酶A是各种酰基化酶的辅酶，由一分子腺苷二磷酸、一
DNB derivative of N-termimal residue
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肼解法（C-末端分析）
氨基酸酰肼 二亚苄衍生物（不溶于水）
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二、酶RNA的化学结构
酶RNA的化学结构主要包括 组成RNA的核苷酸种类、数 目和排列顺序。 4种核苷酸：AMP，GMP ，CMP，UMP 3’-5’磷酸二酯键连接
酸吡哆醛和磷酸吡哆胺的互相转变，起到氨基转移作用
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第二节 酶的化学结构
一、酶蛋白的化学结构 即一级结构，是指蛋白质中的氨基酸按照特定的排列顺序
通过肽键连接起来的多肽链结构。 氨基酸的种类和数目 氨基酸的排列次序 二硫键的数目和位置 肽链的数目等。 每种蛋白质都由唯一而确定的遗传信息决定氨基酸序列 一级结构决定蛋白质的高级结构
β-转角结构中常出现的AA有Gly、Pro、Asp、Asn、Trp等
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-螺旋有左旋和右旋两种， 右旋比左旋更加稳定，因此 也更常见。
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（2）β-片层结构(β－pleated sheet)
又称β-折叠，是两条或多条肽链充分伸展成锯齿状的折 叠结构，通过侧向聚集，形成与肽链长轴方向平行的折扇 状构象。
肽链几乎完全伸展，通过链间的氢键交联维持结构； 肽链的主链呈锯齿状折叠构象，R基团处于折叠平面的两侧。
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（3）肽链数目的确定 通过末端分析等方法测定肽链的数目 通过还原法打开二硫键
在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试 剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。
（4）氨基酸顺序测定 酶蛋白不完全水解→各种小肽→末端分析→综合分析
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分子泛酸和一分子巯基乙胺组成。 (10)生物素 生物素是维生素B的一种，又称维生素H 生物素是羧化酶的辅助因子，在酶催化反应中，起CO2的
渗入作用。
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(11) 硫胺素焦磷酸(TPP) 即维生素B1，是酮酸脱羧酶的辅助因子。 (12)磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺 即维生素B6，是各种转氨酶的辅助因子。 在酶催化氨基酸和酮酸的转氨过程中，维生素B6通过磷
包括二级结构、三级结构、四级结构 基本结构单位：螺旋、折叠、转角、卷曲等结构
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1、酶蛋白的副键
（1）氢键: 肽键中羰基的氧原子等与亚氨基、羟基、氨基 等基团中氢原子联结成的副价键
C O H N
H C O H O C O H N
H
（2）盐键：蛋白质分子中氨基与羧基形成，结合力较强
HO N CO H
酶工程 Enzyme Engineering
林范学fanxuelin@gmail.com
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第二篇 酶的改性
酶的改性（enzyme improviห้องสมุดไป่ตู้g） ：
通过各种方法使酶的催化特性得以改进的技术过程
酶的改性的目的
提高酶的催化效率 增加酶的稳定性 降低或消除酶的抗原性 提高酶的使用效率（反复或连续使用酶） 扩大酶的使用范围（研究酶在水溶液以外的条件下
进行催化反应的特性和条件） 酶的结构与功能的关系研究
2
常用的方法: 酶分子修饰（enzyme molecule modification） 酶分子定向进化（enzyme molecule directed evolution） 酶固定化（enzyme immobilization） 酶非水相催化（enzyme catalysis in non-aqueous phase）
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（3）酯键：蛋白质分子中羧基与氨基酸上的羟基脱水而缩
合而成
O R 1 C O H + O HR 2
H 2 O
O
R 1 C OR 2
（4）二硫键：由蛋白质分子上两个半胱氨酸残基上巯基通 过氧化脱氢而成，对蛋白质稳定性起重要作用
R1—S—S—R2
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（5）疏水键：蛋白质分子中疏水性较强的侧链基团聚集而 成，对稳定蛋白有一定作用；
包括： α-螺旋结构 β-片层结构 β-转角结构 无规卷曲
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（1）α-螺旋结构
Α-螺旋结构是由蛋白质的肽链 环绕中心轴有规则一圈一圈盘 旋而成。 右手螺旋（-helix）
螺距为0.54nm,含3.6个AA残基 两个AA之间的距离为0.15nm； AA残基侧链伸向外侧，相邻的 螺圈之间形成链内氢键； 主要靠氢键维持
肽：一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水 缩合而成的化合物。
肽键（peptide bond）：一个氨基酸的α-COOH
和相邻的另一个氨基酸α-NH2脱水所形成的共价键。
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肽单位：
OH H
CC
N
R1
H C
R2
C—N，半双键性（partial double-bond character），不能旋转
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（4）铜离子 铜离子是铜锌-超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化 酶、细胞色素氧化酶、赖氨酸氧化酶、酪氨酸酶等的辅助因子。
（5）锰离子 锰离子是锰-超氧化物歧化酶（Mn－SOD）、 丙酮酸羧化酶、精氨酸酶等的辅助因子。 （6） 钙离子 钙离子是α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶等的辅助因子。
氨基酸结构 肽键
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7
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二、核酸类酶的基本组成单位——核苷酸
碱基+核糖+磷酸=核苷酸 3’,5’-磷酸二酯键
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5’AMP 5’CMP
5’GMP
5’UMP
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三、酶的辅因子
单成分酶：仅有蛋白质或核糖核酸组成的酶
双成分酶：除了蛋白质或核糖核酸外，还有其他非生物大
分子成分的酶。
决定专一性
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（6）范德华力：借助静电引力而形成，键能较小 （7）金属键：通过金属离子与蛋白质中基团联结而成，维
持蛋白质空间构型有一定作用，在四级结构中联结亚基。
Copper chaperone protein PcoC 铜伴侣蛋白
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2、酶蛋白的二级结构
主要指多肽键主链原子的局部空间排列，一般不考虑侧链 的构象。
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氨基酸：20种
COOH
结构通式:
H2N—Cα—H R
不带电形式
COO+H3N—Cα—H
R 两性离子形式
AA的结构特点∶ α-AA； 除Gly外都具有光学性(有D-和L-型两种光学异构体)。
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α-氨基酸
赖氨酸
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L-型和D-型
丙氨酸
levorotatory
dextrotatory
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铁卟啉是一些氧化酶（如过氧化氢酶、过氧化物酶等）的辅助因子。 它通过共价键与酶蛋白牢固结合 。
(4)硫辛酸
硫辛酸全称为6,8-二硫辛酸。它在氧化还原酶的催化作用中，通过 氧化型和还原型的互相转变而起传递氢的作用 。
(5)核苷三磷酸(NTP)
腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(CTP)、胞苷三磷酸(CTP)、 尿苷三磷酸(UTP)等。它们是磷酸转移酶的辅助因子。
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（2）锌离子 锌离子是各种金属蛋白酶，如木瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶、中性蛋白酶等的辅助因子，也是铜锌-超氧化 物歧化酶（Cu，Zn-SOD）、碳酸酐酶、羧肽酶、醇脱氢 酶、胶原酶等的辅助因子。
（3）铁离子 铁离子与卟啉环结合成铁卟啉，是过氧化物酶、 过氧化氢酶、色氨酸双加氧酶、细胞色素B等的辅助因子。 铁离子也是铁-超氧化物歧化酶（Fe-SOD）、固氮酶、黄嘌 呤氧化酶、琥珀酸脱氢酶、脯氨酸羧化酶的辅助因子。
末端分析
二硝基氟苯（FDNB）法（N-末端分析）
pH8.5
HCl
FDNB + 肽
DNP—肽
-HF
水解
Polypeptide
NO2
NO2
HF
F
FDNB
NO2
6 M HCl
NO2 NH
DNP—AA + 其他AA
NO2 +
NO2 NH
Free AA
DNB derivative of Polypeptide
传递电子、原子或 某些化学基团
全酶 holoenzyme
酶蛋白 + 辅因子（cofactor） 酶RNA + 辅因子（cofactor）
有催化活性
无催化活性
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1. 无机辅因子
无机辅助因子主要是指各种金属离子，尤其是各种二价 金属离子。
（1）镁离子 镁离子是多种酶的辅助因子，在酶的催化中起 重要作用。例如，各种激酶、柠檬酸裂合酶、异柠檬酸脱氢 酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、各种自我剪接的核酸类酶等 都需要镁离子作为辅助因子。
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酶RNA化学结构的测定 核酸自动测序仪
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高通量测序（High-throughput sequencing）又称“下一代”测 序技术（“Next-generation” sequencing technology），以 能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长 较短等为标志。
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(1) 烟酰胺核苷酸(NAD+， NADP+)
B族维生素 许多脱氢酶的辅因子：乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、异柠
檬酸脱氢酶
NAD+：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶I
一般与呼吸链相连，与分解反应偶联：（醇脱氢酶催化伯醇脱氢 生成醛）
R—CH2CH2OH+NAD+=R—CH2CHO+NADH+H+
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传统方法: (1)酶RNA的分离纯化，得到较纯的RNA样品 (2)将RNA水解成各种核苷酸，确定核苷酸的种类和数量 (3)用特异性酶切法或双脱氧终止法进行RNA序列测定
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第三节 酶的空间结构
酶蛋白的空间结构：二、三、四级结构 酶RNA的空间结构：二、三级结构
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一、酶蛋白的空间结构
NADP+：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶Ⅱ 。
一般与合成反应相偶联。
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(2) 黄素核苷酸(FMN和FAD) 维生素B2(核黄素)的衍生物 各种黄素酶(氨基酸氧化酶、琥珀酸脱氢酶等)的辅助因子 FMN：黄素单核苷酸 FAD：黄素腺嘌呤二核苷酸
FMN和FAD的主要作用是传递氢。
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(3)铁卟啉
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2. 有机辅因子
是指双成分酶中相对分子量较小的有机化合物。它们在酶 催化过程中起着传递电子、原子或基团的作用。 (1)传递电子体：如 卟啉铁、铁硫簇； (2)传递氢（递氢体）：如FMN/FAD、NAD+/NADP+ 、CoQ、硫辛酸； (3)传递酰基体：如 CoA、TPP、硫辛酸； (4)传递一碳基团：如 四氢叶酸； (5)传递磷酸基：如 ATP，GTP； (6)其它作用： 转氨基，如 磷酸吡哆醛（VB6） ；传递 CO2，如 生物素。
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平行式 反平行式
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（3）β-转角结构（β－turn）
又称β－转弯或发卡结构，是在球蛋白中发现。 球状蛋白的多肽链经常出现180°的回折，这个回折角就是β
－转角结构；
它由四个AA残基组成; 回折处的第一个AA残基的 -C=O 和第四个AA残基的 –N-H
之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结。