MS培养基的配制,灭菌等注意事项

一、MS培养基母液
注意：1．大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml 烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。

2．微量元素母液的配制
按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。

3．铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。

4．有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。

5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。

1．制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。

2．称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。

．生长调节剂母液配制：
为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。

不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。

激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。

称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。

二、培养基配制和灭菌
一．养培养基配制程序
(一).母液吸取量的计算
配制培养基的升数
公式1：母液吸取量= 母液体积（CC）×——————————
母液浓缩倍数
培养基要求的含量
公式2：母液吸取量= ———————————（各种生长调节剂）
母液每CC的含量
（二）各种母液按顺序编号排列
A.大量元素；
B.CaCl2.2H2O；
C.微量元素；
D.铁盐；
E.有机物；F．生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg ， NAA 用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。

(三) 配制培养基（1000ml）
1.琼脂: 称取5~7g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完
全溶解为止.
2.蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂
的300ml蒸馏水中。

3.各种母液的吸取（培养基1L）
（1）用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2·2H2O母液（B）各100ml
（2）分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml
（3）用10ml移液管或吸管吸取有机物（H）10ml
（4）移取激素
将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80℃左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.8~6.0，过酸过碱则用1N NaoH和1N HCL调整。

二．分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中，每个三角瓶约30ml左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右）注：培养基勿碰瓶壁。

三. 包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌。

用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。

三、高压蒸汽灭菌锅的使用方法
具体操作步骤：
1. 高压锅放水至平把架；
2. 把包扎好的培养基装入高压锅;
3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀.
4. 然后接通电源.
5. 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)。

6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始
计算灭菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟。

7. 灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。

8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。

灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。

进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀→0.11MPa(121℃)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。

四、无菌操作技术
（一）植物材料表面——消毒剂灭菌
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。

这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。

因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。

1.接种步骤：
第一步：清理材料→→流水冲洗→→加入吐温（或洗衣粉）清洗→→自来水冲洗
第二步：对材料的表面浸润灭菌： 70%酒精浸10-30秒→→无菌水第三步：灭菌剂处理→→ 0.1-1%升汞5-8 min（或其他灭菌剂）
第四步：无菌水进行冲洗
注意事项：
１.灭菌剂一般要临时配制，现配现用．升汞可以短期储存．
２.对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗３-４次，升汞一般５-８次，每次不少于３min
３.灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底．
４.灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。

５.灭菌液要充分浸没材料
2.无菌操作可按以下步骤进行：
（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；
（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。

然后搽拭工作台面；
（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；
材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。

（如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。

微茎尖要剥成只含1-2片叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。

（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。

常用植物激素
四、常用药品的配置方法
1.1mol/L HCl的配制：根据盐酸的密度37%盐酸溶液的密度为1.19克/毫升，假设要配制1000ml 1mol/L HCl，则需要盐酸的物质的量为1mol，所以需要量取37%的盐酸为1*36.5/37%/1.19=82ml
2.1mol/L的NaOH的配制：称40gNaOH，然后融于1000ml的蒸馏水中。

（定容到100ml）
3.95%的酒精配制成75%的酒精：用量筒量取750ml的95%酒精加入200ml的蒸馏水即可得到75%的酒精。

如果用无水酒精配制75%的酒精，则量取750ml的无水酒精，再加水250ml。

4.0.1%的升汞配制：先称取1克升汞粉末，然后用蒸馏水溶解最后定容到1000ml。

5. 1mg/ml的2.4-D的配制：称取0.1g2.4-D，用少量1mol/LnaOH 或酒精助溶，然后定容到100ml。

6.1 mg/ml的6-BA的配制：称取0.1g6-BA，用少量1mol/L HCl或1mol/LNaOH助溶，然后定容到100ml。

7.0.5mg/ml的NAA的配制：称取0.05gNAA，用少量95%酒精助溶，然后定容到100ml。