第八章 亲和色谱
亲和色谱
聚丙烯酰胺-琼脂糖 多孔玻璃
1,6-己二胺, 6-氨基己酸 氨基丙基, 氨基己基
第四节 亲和吸附剂的制备
一、要求 ㈠. ㈡. 结 L与基质结合，对L-S结合无干扰； L为小分子有的需“手臂”，使L-S
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
第二节 亲和色谱配基 (ligand L) ㈠ 作为配体的条件
亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活
㈡常用系统
酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物 核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物 激素: 受体、运载蛋白 抗体: 抗原、病毒、细胞 外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞
亲和层析常用配体
连接臂先偶联至载体后接配体
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备 Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-Sep Sep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep 碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
第三节 亲和层析载体
一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好
二、载体的选择
1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污 剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力 比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
4.3
亲和色谱(层析)
Affinity Chromatography, AC 第一节 概述
8 亲和色谱
4)．温度T T 使分子和原子的热运动，结合 中心的静电作用、氢键及金属配位 键，但可使疏水性作用。
5)．离子 SCN-，I-和ClO4-等半径较大的阴离 子能降低疏水相互作用。则这些离 子会降低Affinity。
6). 表面活性剂/乙二醇
7)．鳌合剂 如果Affinity源于亲和分子对与金属离子 形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸 EDTA等鳌合剂除去金属离子，可使 Affinity消失。
Affinity。
许多亲和吸附的目标蛋白质可用高浓度盐溶液洗脱， 说明静电引力在Affinity中占有重要地位。
2)．pH 配体
配基
结合中心
在亲和分离操作中, 溶液pH值的选择是 非常重要的.
3).抑制氢键形成的物质
脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成. 因此,如果Affinity中存在氢键,则加入脲或盐 酸胍可减弱Affinity。但他们为强烈变性剂。
是亲和技术与膜分离相结合的分离 纯化技术，是亲和层析的另一种变形.
优点(兼备亲和吸附与膜分离):
1st 亲和作用高选择性 + 不溶性微粒固定相的亲和配基，从而增 大目标分子与杂分子的尺寸差别，大大提高膜分离的选择性。 使亲和过滤的纯化水平可接近或达到亲和层析；
2nd 膜分离以压差为传质推动力，速度快，易于放大和实现连续 化操作;
吸附的影响因素
亲水性 目标产物
1st 离子强度
疏水性 目标产物
疏水性 杂蛋白
亲水性 杂蛋白
2nd 离子种类
3rd pH Value 4th 杂蛋白
亲和色谱洗脱
可控制的条件
1st 离子强度 2nd pH 3rd 抑制氢键形成的物质
4th 温度
5th 离子
生物分离工程 第八章
8
亲 和 色 谱
（ 6）色素配基——色素亲和色谱
三嗪类色素与需要NAD作为辅酶的脱氢酶和激酶具有结合作 用。此外，还能与血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶和糖解酶 等多种蛋白质具有结合能力。
（7）过渡金属离子（Cu2+、Ni 2+、 Zn2+、Co2+）
过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的 巯基和色氨酸的吲哚基通过配位键产生亲和结合作用。一般称为金 属螯合亲和色谱。
8
亲 和 色 谱
8
亲 和 色 谱
8.5.2 亲和双水相分配
利用偶联有亲和配基的PEG作为成相聚合物进行目
标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和结合作用下 促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物
的分配系数和选择性。
操作步骤：萃取、清洗、反萃取。
8
亲 和 色 谱
8.5.3 亲和反胶团萃取
8
亲 和 色 谱
（ 8）组氨酸
组氨酸具有弱疏水性和咪唑环的弱电性，可与蛋白质发生亲和
结合作用。在低盐浓度和pH值约等于目标蛋白质等电点的溶液中，
固定化组氨酸的亲和吸附作用最强。采用增大盐浓度的梯度洗脱法。
（ 9）肝素
肝素是一种酸性多糖，可与脂蛋白质、脂肪酶、甾体受体、限 制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用。在中性 pH值和低浓度盐溶液中亲和作用较强，随着盐浓度的增大结合作用 降低。
8
亲 和 色 谱
8.3.2 亲和吸附剂及其制备方法
将亲和配基共价偶联在固相载体之上即可制成亲和 吸附剂。 亲和载体的要求 ① 具亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面 积大； ② 稳定性高，机械强度高，使用寿命长； ③ 含有可活化反应基团，用于配基的固定化； ④ 粒径均匀的球形粒子。 凝胶介质是最常用的亲和载体。
Chapter 8 亲和纯化
三、亲和作用体系
①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金 属离子； ②抗体：抗原、病毒、细胞； ③激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白； ④外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体 蛋白、细胞； ⑤核酸（ DNA和RNA ）：互补碱基链段、组蛋 白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；
亲和作用体系的特异性
高度特异性体系：一对一关系，如抗原与其单克
特点
优点 以压差为推动力，速度快，易于放大和实现连续 化操作； 选择性高，纯化水平接近或达到亲和层析； 载体一般为水溶性聚合物或无孔微粒，无内扩散 传质阻力，目标分子的亲和结合速度快； 不需使用高压设备，可弥补高效亲和层析设备昂 贵、放大困难的缺点。 缺点 相当于层析过程的一个理论板，分离效率较低。
第三节 亲和膜
一、原理
利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和 纯化目标蛋白质，是亲和层析的变形，故又称膜
亲和层析。
二、应用及特点
应用：单克隆抗体的纯化、葡萄糖-6-磷酸脱
氢酶（G6PDH）的纯化等。
特点
优点 传质阻力小，达到吸附平衡时间短，配基利用 率高； 压降小，流速高，设备体积小，配基用量低。 缺点 理论板数很低，吸附和清洗效率低； 膜的污染会使操作速度、吸附效率和亲和膜的 寿命下降。
亲和纯化技术 定义：利用生物分子间的特异性结合作用（亲 和作用）的原理进行生物物质分离纯化的技术。 分类：亲和色谱技术、亲和膜分离技术、亲和 沉淀、亲和反胶团、亲和电泳等。
第一节 生物亲和 作用
一、亲和作用的本质
参与亲和作用的两个分子中，其中之一为蛋 白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白
亲和吸附作用只有在特定配基的存在下才能实
亲和色谱精讲PPT课件
一、要求
㈠. L与基质结合，对L-S结合无干扰； ㈡. L为小分子有的需“手臂”，使LS结
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
.
24
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备
3. 需了解L-S的作用机制
如……
.
12
例：酶 有单底物反应、双底物反应
单A E
EA
P E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
.
13
双底物依次
AB E
EA EAB
PQ E
EPQ EQ
须选择A、若选B则吸附时须加A
.
14
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P）
E
E
EA EA（B） EPQ
.
37
其他方法
羰基二咪唑（CDI）法 高碘酸盐法 磺化氟甲基吡啶鎓法 N-羟基琥珀酰亚胺法
.
38
其他亲和吸附剂
聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛 法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固 定到其活化基团上;
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
连接臂的连接
连接臂先接配体后偶联至载体 连接臂先偶联至载体后接配体
.
30
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备
Sep-(CH2)6-NH2 Sep
L-COOH AH-
Sep-(CH2)6-COOH L-NH2
CH-Sep
碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
《亲和色谱》课件
生物工程技术
利用生物工程技术改造蛋白质 或酶，提高亲和色谱的特异性
。
光学检测技术
结合光学检测技术，实现高灵 敏度、高分辨率的亲和色谱分
析。
亲和色谱在各领域的应用前景
生物医药领域
用于蛋白质、细胞、病毒等生物分子 的分离和纯化，为药物研发和疾病诊 断提供支持。
环境监测领域
用于水体、土壤、空气等环境样品中 污染物的分离和检测，为环境治理和 保护提供依据。
农药残留检测
亲和色谱可用于农药残留的检测，通过与农药分 子的特异性结合，实现对农药残留的高灵敏度检 测。
食品营养成分分析
亲和色谱可用于食品营养成分的分析，如维生素 、矿物质等，通过与特定配基的结合，实现对营 养成分的高效分离和检测。
亲和色谱在环境监测领域的应用案例
有毒有害物质检测
亲和色谱可用于有毒有害物质的检测，如重金属、有机污染物等， 通过与特定配基的结合，实现对有毒有害物质的高灵敏度检测。
食品安全领域
用于食品中农药残留、添加剂、毒素 等有害物质的检测和分离，保障食品 安全。
农业领域
用于植物生长调节物质、农药残留等 的分离和检测，促进农业可持续发展 。
亲和色谱的发展趋势和未来展望
智能化发展
通过自动化、智能化技术，提高亲和色谱的 分离效率和准确性。
高通量、高分辨率
开发高通量、高分辨率的亲和色谱技术，满 足大规模样品分析的需求。
稳定性差
亲和色谱的配体和载体在某些条件下可能不稳定，影 响实验结果。
适用范围有限
亲和色谱的适用范围相对较窄，仅适用于具有特异性 相互作用的目标分子。
亲和色谱的改进方向
开发通用型配体
通过研究不同类型分子间的相互作用，开发 出适用于多种目标分子的通用型配体，降低 实验成本。
亲和色谱法的原理及应用
亲和色谱法的原理及应用一、亲和色谱法的原理亲和色谱法是一种利用生物大分子间的特异性相互作用进行分离和纯化的方法。
其原理是通过靶分子与固相上的配体之间产生亲和结合来实现分离。
亲和色谱法利用了配体与靶分子之间的特异性相互作用，如抗原与抗体的结合、酶与底物的结合等，从而实现对目标分子的选择性捕获。
其分离和纯化效果优于传统的分离方法，成为现代生物科学研究中不可或缺的技术手段。
二、亲和色谱法的应用亲和色谱法在生物学和药物研发等领域中有着广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用案例：1.抗体纯化：亲和色谱法广泛应用于抗体的纯化工艺中。
通过将抗体的抗原特异性与配体结合，可以实现对抗体的高效选择性纯化。
2.蛋白质纯化：亲和色谱法在蛋白质纯化中起到了重要的作用。
通过将某一特定结合配体固定在色谱柱上，可以实现对目标蛋白质的选择性捕获。
3.酶底物亲和纯化：亲和色谱法可利用酶与底物之间的亲和结合进行酶的纯化。
通过将底物或类似物固定到色谱柱上，可实现对酶的选择性捕获。
4.核酸纯化：亲和色谱法可应用于核酸的纯化过程。
通过将亲和配体固定在色谱柱上，可以实现对目标核酸的高效分离。
5.生物药物开发：亲和色谱法在生物药物的开发过程中起到关键作用。
通过分离和纯化目标蛋白质，可以获得高纯度的生物药物。
三、亲和色谱法的优势和局限性使用亲和色谱法进行分离和纯化具有以下优势：•高选择性：亲和色谱法可以实现对目标分子的高度选择性捕获，减少了其他杂质的干扰。
•高纯度：亲和色谱法可以获得高纯度的目标分子，满足进一步研究和应用的需要。
•原位纯化：亲和色谱法能够在原位进行纯化操作，避免了传统离心、沉淀等分离步骤。
然而，亲和色谱法也存在一些局限性：•配体选择性：亲和色谱法的成功与否，取决于配体与靶分子之间的相互作用是否特异、强烈，因此选择合适的配体是亲和色谱法的关键。
•杂质的干扰：亲和色谱法在分离和纯化过程中，有时可能会受到杂质的干扰，导致目标分子的选择性捕获不够理想。
chapter8亲和层析
Often need spacer arm
but watch out for adsorption to the spacer!
8.2 亲和色谱原理
2、连接：通过化学反应与活化基团连接
3、手臂化合物：
乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2 • 已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 • 6-氨基已酸 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH • 环氧氯丙烷
• 1，4- 丁二醇缩水甘油醚
8.4 亲和吸附平衡
8.4.1 亲和吸附等温线 亲和吸附平衡基本上可以用Langmuir 或Freundlich等温式表 达。 在吸附浓度较低的范围内，吸附等温线近似为线形 Freundlich型吸附等温式
固体粒子称为配基的载体。
作为载体的物质应具有（6点）：
①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，
使用寿命长； ③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固
定化； ⑤抗微生物和酶的侵蚀； ⑥最好为粒径均一的球形粒子。
常用的载体有 葡聚糖、聚丙烯酰 胺等，近年来 多孔硅胶 和 合成高分 子化合物 载体正在被开发应用于亲和 层析。
其中cm的指数值越小，表示亲和结合力越强，当指数值小于 0.1时，吸附平衡可以用矩形等温式近似。
8.4 亲和吸附平衡
8.4 亲和吸附平衡
8.4.2 色素亲和吸附平衡
色素配基CB为一种生物模拟色素，具有特殊的化学 结构，可以和多种蛋白通过不同机理结合。
生物分离考研课件第8章 亲和分离
2. 亲和层析的洗脱方式
• 特异性洗脱 采用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用 的小分子化合物的溶液为洗脱剂 通过与亲和配基或目标产物竞争性结合洗脱目标产 物。 特异性洗脱条件一般比较温和，有利于保护目标 产物的生物活性
•
非特异性洗脱 通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温 度等理化性质降低目标产物吸附作用的洗脱方法。
IMAC的吸附条件: 在pH值为6.0-9.0吸附 IMAC的解吸附： ①将pH降低到3.0-4.0进行洗脱 ②竟争性洗脱，采用能与金属离子发生作用的物质如咪唑、 组氨酸等进行洗脱 解吸后需要对层析柱进行再生，再生一般采用EDTA。 EDTA不但可以解吸蛋白质，而且将所有结合在层析介质 上的金属离子也一起接洗脱下来。
3. 常用的亲和层析方式 • 核苷酸及辅酶亲和层析 以核苷酸（或辅酶）作为亲和配基，用于纯 化各种脱氢酶和激酶。
常用的辅酶：NAD、NADP、ATP AMP、ADP的腺苷部分与辅酶的结构类似， 同样可作为脱氢酶和激酶的亲和配基。
蛋白质的洗脱一般用辅酶或核苷酸进行洗 脱，如采用NADH梯度洗脱3-磷酸脱氢酶和乳 酸脱氢酶。
亲和作用分子对中被固定的分子称为配基(ligand) 结合常数越大，亲和作用越强
合适 104～108L/mol 生物素(biotin)－亲和素(avidin) 1015L/mol 不可逆
8.2 亲和色谱
利用偶联有亲和配基的层析介质为固定相，根 据生物分子之间的亲和作用进行物质分离的液相 色谱方法。
• 染料亲和层析
三嗪类色素是一类含有三嗪环的活性染料。 这类染料的结构和NAD的结构相似，能与以 NAD为辅酶的脱氢酶和激酶结合。 最常用的活性染料为 Cibacron Blue F 3GA。
chapter8亲和层析-文档资料
基质的选择 可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）
琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、 纤维素。
最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10B
配体的选择：
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞
多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
8.3 亲和色谱介质
8.3.1 亲和配基 酶的抑制剂 A蛋白 辅酶和磷酸腺苷 过渡金属离子 肝素
抗体 凝集素
色素配基 组氨酸
间隔臂
当配基的分子量较小时，将其 直接固定在载体上，会由于载 体的空间位阻，配基与生物大 分子不能发生有效的亲和吸附 作用，如图7-14a所示。 如果在配基与载体之间连接间 隔臂，可以增大配基与载体之 间的距离，使其与生物大分子 发生有效的亲和结合。
8.1 生物亲和作用
8.1.2 影响亲和作用的因素 详见p314
离子强度
pH值
抑制氢键形成的物质 温度
离液离子
螯合剂
8.1 生物亲和作用
8.1.3 亲和作用体系 p316
8.2 亲和色谱原理
许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的 专一分子可逆结合的特性。
如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核 糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系， 都具有这种特性，生物分子间的这种专一结合能力 称为亲和力。
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
《chapter亲和层析》PPT课件
8.1 生物亲和作用
8.1.1 亲和作用的本质：钥匙和锁孔的关系
相互作用
静电作用
氢键
疏水性相互作用 配位键
弱共价键
8.1 生物亲和作用
8.1 生物亲和作用
• 生物体内相互作用的分子对： • (1) 酶—底物或抑制剂或辅酶 • (2) 抗原—抗体。 • (3) 激素—受体。 • (4) 糖蛋白与凝集素, • (5) 生物素—生物素结合蛋白等
精选ppt
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基质的选择 可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）
琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、 纤维素。
最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10B
配体的选择：
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
不能发生结合反应的杂 质分子（图8.2中△分子） 直接流出。
经清洗后，选择适当的洗 脱液或改变洗脱条件进行洗
解吸
脱（图中c），使被分离物质 与固定相配基解离，即可将
目标产物分离纯化。
精选ppt
17
8.2 亲和色谱原理
8.3 亲和色谱介质
一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和 配基来修饰固体粒子，以制备所需的亲和吸附介质 （固定相）。
8.1 生物亲和作用
8.1.2 影响亲和作用的因素 详见p314
离子强度
pH值
抑制氢键形成的物质 温度
离液离子
螯合剂
8.1 生物亲和作用
8.1.3 亲和作用体系 p316
8.2 亲和色谱原理
许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的 专一分子可逆结合的特性。
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but watch out for adsorption to the spacer!
8.2 亲和色谱原理
8.1 生物亲和作用
8.1.1 亲和作用的本质：钥匙和锁孔的关系
相互作用
静电作用
氢键
疏水性相互作用 配位键
弱共价键
8.1 生物亲和作用
8.1 生物亲和作用
• 生物体内相互作用的分子对： • (1) 酶—底物或抑制剂或辅酶 • (2) 抗原—抗体。 • (3) 激素—受体。 • (4) 糖蛋白与凝集素, • (5) 生物素—生物素结合蛋白等
8.1 生物亲和作用
8.1.2 影响亲和作用的因素 详见p314
离子强度
pH值
抑制氢键形成的物质 温度
离液离子
螯合剂
8.1 生物亲和作用
8.1.3 亲和作用体系 p316
8.2 亲和色谱原理
许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的 专一分子可逆结合的特性。
如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核 糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系， 都具有这种特性，生物分子间的这种专一结合能力 称为亲和力。
• 凝集素（Lectin）是指一种从各种植 物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖 蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血 球（含血型物质），故名凝集素。
• 常用的为植物凝集素 （Phytoagglutin，PNA），通常以其 被提取的植物命名，如刀豆素A （Conconvalina，ConA）、麦胚素 （Wheat germ agglutinin，WGA）、 花生凝集素（Peanut agglutinin， PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）等，凝集素是它们 的总称。
亲和色谱原理和方法
亲和色谱原理和方法
亲和色谱法
相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。
例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物，用来作为层析用固定相，将另一方从复杂的混合物中选择可逆地截获，达到纯化的目的。
可用于分离活体高分子物质、过滤性病毒及细胞。
或用于对特异的相互作用进行研究。
亲 和 色 谱
亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称 对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是 抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配 基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功 能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的 固相化。亲和色谱法的基本过程是： 1.配基 固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物 质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附 剂后装柱（称亲和性）。
亲和色谱分离的方法随每种分离物质的不同 而有不同。一般推荐使用的程序如下： 1.选 择配基；2.选择偶联凝胶；3.偶联配基；4. 装填合适的柱；5.平衡（2-3倍体积缓液）； 6.应用样品；7.洗涤未结合物质；8.洗 脱结合物质→除盐；9.再生
解离常数 ：
• 药物与结合位点(受体)的结合反应中，药物
与结合位点复合物解离的平衡常数，与药 物和结合位点间的亲和力成反比。
亲 和 色 谱
一、基本理论 二、实验方法
一、基本理论
（一）原理
在生物体内，许多大分子具有与某些相对 应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原 和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、 RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。 生物分子之间这种特异的结合能力称为亲 和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的 原理，建立起来的色谱法称亲和色谱法。
选择配基有两条标准：第一是蛋白质和配基之间 必须有强的亲和力，解离常数在5mM以上不是好 配基； 相反亲和力太高也是有害的，因为在解离 蛋白质──配基复合物时所需的条件就要强烈， 这样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作 配基纯化含生物素的羧化酶时，生物素──抗生 物素蛋白复合物的解离常数达10-15M，解离时需 要pH1.5，6M盐酸胍，在这种条件中羧化酶大多 数已经变性；第二是，配基必须具有适当的化学 基团，这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结 合，但可用于活化和载体相连接，同时又不和吸附。将含有纯化对象的混合物通 过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物 质流出色谱柱。 3.解吸附。用某种缓冲液 或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的 欲纯化物质洗脱出来。
8章 亲和纯化
8.1 生物亲和作用一、生物亲和作用的概念生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。
这种识别并结合的能力具有排他性，即生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。
生物间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用(bioaffinity)或简称亲和作用(affinity)，通过亲和作用发生的结合称为特异性结合(specific binding)或亲和结合(affinity binding)。
利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和分离(affinity separation)或亲和纯化（affinity purification），其典型代表为亲和色谱(affinity chromatography)。
二、亲和作用的本质参与亲和作用的两个分子(或物质)中，其中之一为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质。
蛋白质是高分子化台物，种类繁多，结构复杂。
因此，蛋白质参与亲和作用的机理向不完全清楚。
一般认为，蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构，能与该蛋白质发生亲和作用的分子恰好可以进入到此凹陷结构中，或者该蛋白质的凸起部位恰好能够进入与其发生亲和作用的分子(一般也是蛋白质)的凹陷部位，就象钥匙和锁孔的关系一样。
蛋白质分子表面的凹陷或凸起部位与整个蛋白质分子相比要小得多，例如，球形蛋白质的直径一般为几纳米到十几纳米，而结合部位的直径一般为1~2nm。
由于不是整个分子或物质参与亲和结合，亲和作用的分子（物质)对可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。
具有亲和作用的分子(物质)对之间具有“钥匙”和“琐孔”的关系是产生亲和结合作用的必要条件。
除此之外，还需要分子或原子水平的各种相互作用才能完整地体现亲和结合作用。
1.静电作用天冬、谷、半胱氨酸、C末端的羧基带负电荷精、赖、组氨酸、N末端的a-氨基带正电荷2.氢键O-H-O（0.26nm)或O-H-N （0.28~0.30nm)3.疏水性相互作用一个分子中含有芳香环或烃基链等疏水基4.配位键Cu2+、Zn2+、Ni2+5.弱共价键氨基—甲酰基的Schiff碱、醛基—羟基的半缩醛基三、影响亲和作用的因素1.离子强度提高离子强度降低或消除氢键作用，增大疏水作用。
亲和色谱
亲ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ层析原理图
影响亲和色谱的因素
• 1、上样体积 若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积 对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度 要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。 • 2、柱长 亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果 亲和介质的载量(同上 求解释T ^T)高，与目标产物(目标物)的 作用力强，可以选择较短的珠子(柱子);相反，则应该增加柱 子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。 • 3、流速 亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡 需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢， 保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间 结合力弱和样品浓度过高时。 • 4、温度 温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附 能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一 般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在 上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲 和力，充分地结合;而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离 物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。 例如，一般选择在4℃进行吸附，25℃下进行解
亲和色谱法
生物工程领域 2016-6-13
生物亲和作用
• 定义：生物物质，特别是酶和抗体等蛋白 质，具有识别特定物质并与之相结合的能 力。这种识别并结合的能力具有排他性， 即生物分子能够区分结构和性质非常相近 的其他分子，选择性地与其中一种分子相 结合。这种特异性的相互作用称为生物亲 和作用（bioaffinity）或简称亲和作用 (affinity)。
例：抗原抗体的特异性结合
电镜图片
抗原抗体结合示意图
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第八章亲和色谱( Affinity chromatography)
第一节生物亲和作用
•生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合——生物分子间的这种特异性相互作用称生物亲和作用，通过亲和作用发生的结合称为特异性结合或亲和结合。
一、生物亲和作用的概念
•亲和作用是分子之间的结合作用，自然界普遍存在的现象，生物分子间的亲和作用具有更高的选择性二、亲和作用的本质
必要条件：钥匙和锁孔的关系
此外，还需要具备相互作用：
静电作用；氢键；疏水性相互作用；配位键；弱共价键
•(1) 离子强度三、影响亲和作用的因素静电引力
减弱或完全破坏亲和作用氢键疏水相互作用亲和作用增大静电引力在亲和作用中占重要地位，所以一般可以用高盐洗脱
•蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离基团，不同解离基团的解离常数不同。
•(2) pH 值
如果，静电引力对亲和作用的贡献最大，pH 就会严重影响亲和作用。
溶液pH 值选择非常重要。
•(3) 抑制氢键形成的物质
•(4) 温度
•(5) 离液离子
•(6) 螯合剂
四、亲和作用体系
第二节亲和色谱原理
•将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固定粒子共价偶联，可以特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子容易从混合物中得到选择性分离纯化。
•亲和作用分子对中被固定的分子称为其亲和结合对象的配基，亲和色谱的固定相是键合亲和配基的亲和吸附介质。
•操作一般分为进料、杂质清洗、目标产物洗脱和色谱柱再生等4个步骤。
配基
不溶性母体载体或担体
当用小分子化合为作为配基时，由于空间位阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常在母体与
间隔臂以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。
第三节亲和色谱介质
•①酶的抑制剂与酶的活性部位结合
•生物大分子或小分子化合物
•②抗体单抗和多克隆抗体免疫亲和色谱•③A蛋白相对分子量约42000,与抗体结合,但不影响抗体与抗原结合可用于分离抗体-抗原复合体•④凝集素与糖特异结合的蛋白质的总称,如刀豆蛋白可用作糖蛋白、多糖、糖脂等的亲和配基。
亲和配基
•⑤辅酶和磷酸腺苷脱氢酶和激酶的亲和配基•⑥色素配基脱氢酶、激酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶和糖解酶等
•⑦过渡金属离子
•Cu 2+，Ni 2+，Zn 2+和Co 2+等可与组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基亲和结合。
与咪唑基的结合顺序是Cu 2+＞Ni 2+＞Zn 2+＞Co 2+
•⑧组氨酸
•较低盐浓度、pI时亲和吸附蛋白质,分离pI相差较大的蛋白质,洗脱用增大盐浓度的梯度洗脱法•⑨肝素
•存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖，亲和吸附脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等
亲和层析包括进料吸附、清洗、洗脱和介质再生几个步骤。
吸附操作要保证吸附介质对目标产物有较高的吸附容量，杂质的非特异性吸附要控制在尽可能低的水平。
一般杂质的非特异性吸附与其浓度、性质、载体材料、配基固定化的方法以及流动相的离子强度、pH 和温度等因素有关。
第四节亲和色谱过程分析
缓冲液的离子强度要适当
料液流速是影响层析速度和效果的重要因素。
提高流速虽可加快分离速度，但会降低柱效。
此外，琼
清洗操作目的是洗去介质颗粒内部和颗粒间空隙中的杂质，一般使用与吸附时相同的缓冲液。
洗脱
目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。
特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。
非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。
，直到无亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充
1）层析前：配基
载体2）洗脱：包括：非特异性洗脱和特异性洗脱
亲和层析操作：
亲和层析专一性高，操作条件温和，过程简单，纯化的倍数可达几千倍级，能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离极为有效，它是一种专门用于分离纯化生物大分子的层析分离技术。
第五节亲和色谱的应用
配基不易得到，亲和吸附剂制备复杂。
1）纯化大分子物质
2) 研究酶的结构与功能：
应用
8.5.1 t-PA的纯化—酶的抑制剂为亲和配基
组织纤维溶酶原激活物剂
8.5.2 干扰素的纯化—免疫亲和色谱
8.5.3 脱氢酶的纯化—色素亲和色谱
8.5.4 淀粉酶抑制剂的纯化—固定化金属离子亲和色谱
固定化金属离子亲和色谱（IMAC）根据蛋白质表面与金属离子螯合的氨基酸残基（如咪唑基、巯基和吲哚基等）的含量和分布的差别分离纯化蛋白质；
适用范围广，无毒副作用，吸附容量高。
采用提高离子强度或降低pH值的逐次或线性洗脱法。
当蛋白质的亲和吸附作用很强时，可利用EDTA等螯合剂，将蛋白质和金属离子一起洗脱下来。
基因重组技术医药产品:干扰素、白细胞介素(IL)、集落刺激因子、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)和促红细胞生成素(EPO)等。
将具有特殊分子识别作用的基团(如氨基酸、肽链、蛋白质等)的基因与目标产物的基因克隆相连接，制备融合基因，则此融合基因的表达产物就是连接有特定分子识别基团的目标蛋白质—基因重组融合蛋白质，简称融合蛋白。
8.5.5 基因重组融合蛋白的纯化
本章作业
•1.什么是亲和作用?
•2.亲和作用的本质包括哪些方面?•3.影响亲和作用的因素?
•4.亲和色谱的原理是什么?
•5.亲和色谱的配基有哪些?
•6.亲和色谱的应用有哪些方面?。