中国农业大学食品学院生物化学知识点总结

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第十一章DNA的复制

DNA生物合成概述:

核酸的生物合成是模板指导下进行的，模板有DNA和RNA.因此,DNA合成分为DNA为模板的DNA复制和RNA

为模板的逆转录

DNA合成主要原料为四种脱氧核苷三磷酸

酶系和辅助因子的参与

本章主要讲解DNA复制

以原来DNA分子为模板合成出具有相同分子的过程,自我复制

一.DNA的半保留复制

1958年,Meselson&Stahl氯化铯梯度离心实验

多种真核和原核生物做了类似实验,证明DNA的复制为半保留复制，但由于实验研究中的DNA均为提取的片断,反映复制前和复制后的状态

1963年，Cairns用放射自显影的方法观察到完整的正在复制的大肠杆菌染色体DNA

DNA的半保留复制

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以双链DNA分子的每一条链为模板，按照碱基配对的原则，合成出两个与原DNA分子碱基顺序完全一样的新DNA分子，其中每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式为半保留复制二.DNA复制的起点和方式

复制子:基因组能独立进行复制的单位,包含控制复制的起点和复制的终点.

单一复制子和多复制子

复制的起点:特殊的碱基序列能与控制复制开始的蛋白质或酶特异识别,结合,复制开始

复制叉:复制开始,两条链解开,形成的叉形结构.

复制终点:原核生物环状DNA分子具有特殊的碱基序列,终止复制.真核生物不同复制叉相遇,复制终止.

复制方向和复制方式

三.DNA的半不连续复制

随着复制叉的延伸,DNA的两条母链分别合成与其互补的子链,目前分离到的催化DNA形成的聚合酶的合成方向都是5→3,DNA在复制时如何同时作为模板合成其互补链?

半不连续复制当DNA复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的，因此称半不连续复制；前导链；滞后链

四.DNA复制有关的酶和蛋白质

1.DNA聚合酶

DNA的复制、校对和修复

1956年Kornberg从大肠杆菌中发现DNA聚合酶,其他生物找到该种类型的酶

在有模板和Mg2+存在下催化四种脱氧核糖核苷三磷酸合成DNA

DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加到已有核酸链的游离3-羟基上,合成需要引物链存在

合成需要模板指导,合成的DNA链只与模板有关,与底物比例无关

催化合成方向为5→3

大肠杆菌DNA聚合酶

DNA聚合酶I

1956年,Kornberg大肠杆菌分离得到,FW103kD,单链蛋白球型分子,直径约为DNA的三倍,400个/细胞

三个活性中心:DNA聚合酶活力,1000bp/min;3→5核酸外切酶活力,校对;

5→3核酸外切酶活力,修复、引物链去除

蛋白酶将DNA聚合酶作有限水解,得到两个片段,大片段具有聚合酶和3→5核酸外切酶活力,小片段具有

5→3核酸外切酶活力

合成速度太慢,复制叉移动速度的1/20;持续合成能力差,合成50bp与模板分离;遗传分析,缺陷型DNA复制基本正常

不是主要的复制酶,修复酶

DNA聚合酶II

多亚基酶,聚合活力较DNA聚合酶I稍高,引物为带缺口的双链DNA,无5→3外切酶活性，100个/细胞

功能：可能在DNA的修复中起重要作用

DNA聚合酶III

多亚基组成,催化聚合速度高,10-20个/细胞,被认为大肠杆菌真正的复制酶

现认为DNA聚合酶全酶由10种亚基组成的复杂的二聚体

DNA聚合酶III的结构模式图

DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ

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1999年发现,DNA受到损伤时,诱导产生这两种酶,对损伤部位进行复制,但修复错误率高

真核生物DNA聚合酶

哺乳动物发现五种:α,β,γ,δ,ε及各自作用

2.拓扑异构酶

功能：DNA超螺旋松弛,消除解链产生的扭曲张力

TopI:单链蛋白质,广泛存在于原核和真核生物转录区,在转录过程中发挥作用切开超螺旋DNA的两条链中的一条，切口末端反超螺旋转动，闭合

TopII:DNA旋转酶，多链蛋白质，广泛存在于原核和真核生物染色质骨架蛋白和核基质部位，与复制有关,同时切开两条链，DNA松弛，切口封接

3.解螺旋酶

将DNA双链碱基氢键打开,成两条单链,每解开一对碱基消耗两分子ATP,方向为沿5→3模板链延伸,解

螺旋酶有多种类型,其中DnaB为大肠杆菌参与DNA复制的解螺旋酶;T抗原为真核生物DNA复制的解螺旋酶4.引物合成酶

复制的起始点处合成一段RNA引物,前导链的引物比冈崎片段引物略长约10-60b,DNA聚合酶III或DNA聚合酶α和δ在引物上3端合成DNA

5.DNA连接酶

催化双链DNA连接，切口处5－磷酸基和3－羟基生成磷酸二酯键

6.复制相关蛋白

DnaA,DnaC:大肠杆菌中与复制起始相关DnaA蛋白与ATP结合为活性形式,与ADP结合表现为无活性

单链结合蛋白(SSB):与解开的单链相结合,防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解

真核生物

增殖细胞核抗原,相当于β因子的功能

RF-C夹子装置器,相当于γ复合物

RP-A单链结合蛋白

RNaseH1和MF-1(5→3核酸外切酶)

五.大肠杆菌DNA复制过程

起始,延伸和终止三个阶段

复制体:在DNA的复制叉上,分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白质因子构成的复合物称为复制体,随复制的进程复制体结构发生变化

复制的起始

20-40个活性DnaA结合,并聚集在一起,HU类组蛋白,与DNA结合,促使双链DNA弯曲,并缠绕在DnaA的聚集体上,形成起始复合物

起始复合物形成,影响附近三个连续的13bp的共有序列,使此区域DNA双链解开称为开链复合物

DnaB六聚体在DnaC的帮助结合到解链区,利用水解ATP产生的能量进行解螺旋,同时SSB结合到单链DNA上,拓扑异构酶消除解链产生的扭曲张力,形成前引发复合体

引物合成酶结合其上合成RNA引物,DNA聚合酶开始聚合反应复制开始

DNA复制的调节发生在起始阶段:DNA甲基化,DnaA活性.

起始区的245bp序列中共有11个4bpGATC序列,Dna甲基化酶能使A甲基化,甲基化的双链DNA再与活性的DnaA 蛋白结合形成起始复合物.单链甲基化不能形成起始复合物.DNA复制完成后该区域的子代链的甲基化需要一

定的延滞期,与细胞分裂过程有关,通过DNA起始区与膜结合影响甲基化.

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Dna的活化有关,编码区位于起始区的附近,其转录启动子的甲基化与起点区甲基化需要同样的延滞期.是否DNA的复制起始与该启动子的转录间存在一定的联系?

复制的延伸

前导链和滞后链的合成过程

前导链:引物合成酶合成RNA引物,DNA聚合酶III催化聚合反应,连续过程.

滞后链:引物合成酶合成RNA引物,DNA聚合酶催化形成冈崎片段,DNA聚合酶I和连接酶催化下将冈崎片段连接

前导链和滞后链由DNA聚合酶III的两个核心酶催化,它们之间如何实现协调一致?

复制的终止

细菌环状DNA两个复制叉不断前移,最后在终止区相遇并停止复制.终止区含有多个终止子,终止子能与特定蛋白Tus结合形成复合物,阻止对侧复制叉超越.最后,两个复制叉停复制,形成连锁环,由拓扑异构酶Ⅳ参与将连锁环解开,DNA修复方式封闭.

六.真核生物DNA复制

真核生物与原核生物DNA复制的差异

核小体的解聚和核小体的重组装

多起点双向复制,复制起点是自主复制序列,在消耗ATP条件下能与由六个蛋白质组成的复合物结合成起点识

别复合物,控制复制的起始.

复制子的复制速度慢，复制起点多,多复制子

染色体复制全部结束前复制子只进行一次复制，原核生物在营养充足,快速生长状况下可以多次复制

真核生物与原核生物DNA聚合酶存在差别,复制体结构组成不同,调控复杂,染色质结构,甲基化及转录活性有