动物免疫学实验指导

动物免疫学实验指导

第二版

徐春厚谢为天雍艳红编

动物医学生物技术专业用

广东海洋大学教材科出版

二00七年二月二十八日

目录

实验一凝集试验 (1)

实验二沉淀试验 (4)

实验三溶血试验 (8)

实验四病毒的血凝及血凝抑制试验 (10)

实验五 E-玫瑰花环试验 (13)

实验六 EA玫瑰花环试验 (15)

实验七 EAC玫瑰花环试验 (17)

实验八酶联免疫吸附试验 (18)

实验九荧光抗体技术 (20)

实验十多克隆抗体（免疫血清）的制备 (22)

实验一凝集试验

颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。

细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。

凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。[目的要求]

1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。

2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。

3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。

[材料与试剂]

1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。

2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。

3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。

4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。

[实验内容及操作方法]

（一）试管凝集试验

以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。

1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检血清有多份，对照只需做1份。

2. 被检血清稀释：第1管加入2.3 ml0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml弃之，再吸取0.5 ml加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml（见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、1:50、1:100。

3. 对照管制作：第5管中加0.5% 石炭酸生理盐水0.5ml，第6管加1:25稀释的布氏杆菌病阳性血清0.5 ml，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5 ml。

4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5% 石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5 ml。

表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）

5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。

6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。

＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。

＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。

＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。

＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。

－：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。

7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。

牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。

[注意事项]

1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。

2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。

（二）布氏杆菌病平板凝集试验

1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm2），并注明被检血清号码，以100μL 微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80μL、第2格40μL、第3格20μL、第4格10μL。血清用前需放室温，使其温度达20℃左右。每一份检样需换一个tip头。

大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40μL 和20μL ；猪、山羊、绵羊、狗用80μL和40μL。

2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30μL，滴在血清附近，而不与血清接触。从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。

抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃左右。

3. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃左右，3-5min内记录反应结果。

4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。

5. 结果判定：按下列标准记录反应结果。

＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透明，即100% 凝集。

＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75% 凝集。

＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即50% 凝集。

＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25% 凝集。

－：液体均匀混浊，无凝集现象。