基因工程实验操作

基因工程综合实验操作

大肠杆菌常规培养

大肠杆菌在LB（Luria–Bertani）液体培养基中，37℃水浴摇床培养12-16小时。在LB固体培养基中，置于37℃培养箱培养12-16小时。如果培养用于提取具有氨苄青霉素（Amp）抗性基因质粒（如pUC18）的菌体，则需在培养基中加入100 mg/ml的氨苄青霉素。在重组子克隆的鉴定培养中，LB固体培养基中还要加入特定的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷（X-gal），浓度为40 mg/ml，以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG），浓度为50 mg/ml。

大肠杆菌染色体DNA的抽提

1. 大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时，6000rpm，4℃，离心10分钟收获菌体沉淀。

2. 沉淀中加入

3.6 ml Buffer A（含溶菌酶5 mg/ml），旋涡振荡混匀，37℃保温30分钟。

3. 加入400 ml 10% SDS使最终浓度为1%，混匀，37℃保温30分钟或澄清即可。

4. 加入10 ml 20 mg/ml的ProK至最终浓度为1 mg/ml，60℃保温60分钟。

5. 加入1 ml预先冷冻的5 mol/L NaCl至最终浓度为1 mol/L，充分混匀后冰浴30分钟。

6. 4℃，15 000 rpm，离心30min。

7. 取上清加入等体积（5 ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后4℃，15000 rpm，离心30分钟。

8. 取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000 rpm，4℃，离心10分钟。

9. 取上清加入0.8 V（4 ml）异丙醇充分混匀后-20℃放置30分钟以上，4℃，15000 rpm，离心30分钟。

10. 弃上清，沉淀用3ml 70%的冰乙醇洗涤，4℃，15000 rpm，离心5分钟。

11. 弃上清，沉淀于37℃凉干后，用1 ml ddH2O 溶解并移入Eppendorf管中。

12. 取5 ml电泳。

Buffer A Tris-HCl (pH8.0) 10 mM

EDTA (pH8.0) 20 mM

DNA酶切

在Eppendorf管中建立如下酶切反应体系：置于37℃保温1.5小时，然后电泳检查

质粒DNA 5 ml

限制性内切酶 1 ml

10×酶切缓冲液 1.5 ml

无菌重蒸水8.5 ml

总体积15 ml

DNA琼脂糖凝胶电泳

1. 用1×TAE–buffer配制0.7%的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。

2. 待溶液冷却至60℃左右，加入溴化乙锭（用水配1 mg/ml贮存液）至最终浓度为0.5 mg/ml，充分混匀。

3. 用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度

在3-5 mm之间。

4. 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1×TAE-buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使

缓冲液没过胶面约1 mm。

5. DNA样品与溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。

6. 盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极（红线）移动。采用100V电压进行电泳。

7. 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。

50×TAE-buffer

Tris 242 g/l

冰醋酸57.1 ml/l

EDTA 0.4 g/l

DIG分子杂交

I．DNA转移和固定

1. 大肠杆菌染色体DNA（各1-2 mg）分别用BamHI、EcoRI、PstI、HindIII酶切，电泳。

2. 电泳拍照（胶边摆放尺以用于杂交阳性条带的定位），搭建转移台，在盛有0.4N NaOH 的容器中依次摆放支架、玻板、普通滤纸、塑料薄膜（剪掉比凝胶尺寸略小一号的一块）、凝胶、尼龙薄膜和卷筒纸及500克重物，放置过夜。注：在摆放过程中要防止气泡的产生

3. 次日取出尼龙膜，在槽口处用圆珠笔标记后，在6×SSC中洗涤30s，放于牛皮纸上，于80℃烘2h，放入保鲜膜内于–20℃存放或立即杂交。

II．oligonucleotide tailing

1. 用无菌水溶解oligonucleotide至适当浓度。

2. 在插入冰中的管中混合：

oligonucleotide 100pmol

反应缓冲液（vial 1） 4 ml

CoCl2溶液（vial 2） 4 ml

DIG-dUTP溶液（vial 3） 1 ml

dA TP溶液（vial 4） 1 ml

TdT（50units）（vial 5） 1 ml

加无菌水至终体积20 ml。

3. 37℃保温15min，然后置于冰中，加入2 ml糖原溶液（1 ml vial 9 + 200 ml 0.2M EDTA，pH8.0）。

4. 终止标记反应后，加入2.5 ml 4M LiCl，75 ml 乙醇（-20℃预冷），沉淀oligonucleotide。

5. 至少在-70℃放置30分钟或-20℃放置2h，15000转/分离心20min。

6. 沉淀用50 ml 70%乙醇洗涤、晾干，用适当体积的无菌水溶解，保存于-20℃。

III．预杂交和杂交

1. 把尼龙膜放入杂交管中，按20 ml/100 cm2 加入预杂交液，于杂交炉中68℃保温至少

1 h。

2. 将DIG标记的DNA探针（5~25ng/ml）煮沸10 min，迅速插入盐冰中变性。

3. 弃此预杂交液，按2.5 ml/100 cm2膜加入含5-25 ng/ml标记探针的杂交液。

4. 膜在杂交温度保温6-16 hr。

5. 在杂交温度洗涤：

a 至少50 ml/100 cm2 2×SSC，SDS，0.1%（w/v） 5 min 2次

b 0.1×SSC，SDS，0.1%（w/v） 5 min 2次

6. 膜可立即检测或晾干后保存。

IV. 免疫检测

1. 杂交后严格洗涤，把膜直接浸入Washing buffer中1-5 min。

2. 在100 ml Blocking solution（1×conc）放置30 min。

3. 用Blocking Solution（1×Conc把anti-DIG-AP conjugate稀释至150 mU/ml，50 ml中有10ml anti-DIG-AP conjugate）。

4. 膜在50 ml抗体溶液中放置30 min。

5. 100ml Washing buffer洗膜15 min×2次。

6. 膜在20 ml Detection buffer中平衡2-5 min。

7. 膜在新配的10 ml Color-substrate solution中放置5 min（置于黑暗中），注意在显色过程中不要摇动。

8. 几分钟后有色物质开始生成，反应一般在16 h后达到完全。

9. 颜色达到一定强度后，可用50 ml H2O洗膜5 min来终止反应。

10. 结果拍照保留。

20×SSC

NaCl 3 mol/l

Na-citrate 0.3 mol/l pH 7.0

Buffer 1

Maleic acid 0.1 mol/l

NaCl 0.15 mol/l pH 7.5 用固体NaOH调节

10×Blocking

Blocking reagent 10% 溶于Buffer 1，灭菌后存于4℃

杂交Buffer 用于寡核苷酸探针的杂交

5×SSC

Blocking reagent 1% 使用前加入polyA（vial 11）

N-lauroylsarkosine 0.1% 终浓度为0.1mg/ml

SDS 0.02%

2×预杂交液用于DNA片段探针的杂交

12×SSC 使用时加入SDS，终浓度为0.5%

10×Denhardts 试剂

鲑鱼精子DNA碎片200 mg/ml