基因工程：第二章 分子克隆(总)(1)

二、质粒(plasmid)
质粒的生物学特性 质粒载体的特点与类型 几个重要的质粒载体 质粒的制备与鉴定
（一）质粒的生物学特性
质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并 被稳定遗传的一类DNA分子。
*质粒常见于原核细菌和真菌中 *绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，
基因工程
基 因 工 程 基 本 流 程
第二章 分子克隆单元操作
2.1 用于基因克隆的载体 2.2 DNA的体外重组（切与接） 2.3 转化与扩增（转与增） 2.4 转化子的筛选与重组子的鉴定（检） 2.5 目的基因的克隆 2.6 基因操作常用技术
基因工程课程内容
1 基因工程概论 2 分子克隆单元操作 3 大肠杆菌基因工程 4 真菌基因工程 5 高等动物基因工程 6 高等植物基因工程 7 蛋白质工程、途径工程
Pvu I Pst I
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
Apr
Tcr
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Bal I
Origin of Replication
( ori )
Hind II
质粒的复制调控：调控区紧邻ori，方便构建 调控区编码RNAI（反义）和Rop蛋白，抑制复制引物RNAII与模 板结合
改造策略：去掉复制和维持非必须序列；失活复制负调控序列； 引入多克隆位点；引入理想的筛选标记基因
pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr
野
生 质
ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大Baidu Nhomakorabea杆菌内毒素标记基因 E1
3、载体类型 1）按功能分：
克隆载体（cloning vector）
主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因，或在大肠 杆菌或酿酒酵母细胞中构建基因文库。
表达载体（expression vector)
除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启 动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目 的基因。
2、质粒的不相容性
质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒 ，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成 不相容性群 以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒 的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和 mob 基因决定
2.1 用于基因克隆的载体
载体的基本概念 质粒载体 噬菌体或病毒载体 考斯质粒与噬菌粒 人工染色体载体
一、载体的基本概念
载体（Vector）：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细 胞，使之传代、扩增或表达的工具。 载体的主要功能：
运载：高效运载外源基因至受体细胞内
维持：自主复制或整合至宿主基因组，以达传代目的 扩增：使外源基因拷贝数增加（克隆载体） 表达：为目的基因表达提供顺式元件（表达载体）
质粒的不相容性的分子机制
两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 可导致子代细胞质粒组成不同，且这种差异具随机性，经过 若干代后宿主细胞中处于数量弱势的质粒必然被淘汰，而仅 剩强势质粒。
3、质粒的可转移性
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
即cccDNA（covalently closed circular DNA) *质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb
1、质粒的自主复制性
质粒是独立的复制子（ replicon）：含复制起始位 点（origin, ori )和控制复 制频率的调控基因
能利用宿主细胞的DNA复制 系统进行自主复制
如何通过质粒改造提高质粒的拷贝数？
抑制蛋白质 Cop
起始因子 Rep
Pcop
cop
P/Orep
rep
ori
根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：
严紧型复制控制的质粒： 1 - 3 拷贝，如pSC101 松弛型复制控制的质粒： 10 - 60 拷贝，如 ColE1 氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素 抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒 迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。
4、携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得宿主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
天然质粒的改造
野生型质粒的缺点： 分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想
RNA II（引物）
复制方向
3’
5’
5’ RNA I
E.coli ColE1 plasmid
ori
rop
（+）
63个氨基酸,提高 RNAI的抑制
3’
Rop
阐述质粒DNA复制调控机理的分子模型
1、抑制蛋白质稀释模型 2、自体阻遏蛋白质模型
调控区编码抑制蛋白Cop，控制复制起始因子与复制起始位点 （ori）的结合
2、载体应具备的条件
可转移性：具有针对受体细胞的“亲缘性”或“亲和性”（导入效率） 可传代性：具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点（稳定遗传） 可筛选性：具有合适的筛选标记
方便外源基因克隆：具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 (多克隆位点 )
具有一定的装载能力：在插入外源基因后仍能有效转化宿主 基因文库构建需要非常大的容量
3、载体类型
2）按传代特性分：
自主复制型载体 含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代。 穿梭载体 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆 整合型载体 不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主 基因组。
3、载体类型 3）按来源分：
质粒（Plasmid) 噬菌体（bacteriophage)/病毒(virus) 考斯质粒（cosmid） 噬菌粒（phagemid） 人工染色体（YAC，BAC）