测定单糖组分

一株硅酸盐细菌胞外多糖的单糖组分分析

题目简介（200字以内）

硅酸盐细菌是最重要的土壤细菌之一，可以利用有限的营养大量生产多糖。硅酸盐细菌的胞外多糖具有很好的絮凝作用，絮凝特性要优于许多微生物，通常用于废水处理。在不同培养条件下，硅酸盐细菌的胞外多糖含量差异较大。据文献报道在培养基中加入矿粉，可以提高硅酸盐细菌的胞外多糖含量，发酵液外观较对照组差异显著。本研究将通过苯酚-硫酸法、DART-MS技术来确定不同培养条件下多糖含量和单糖组分的差异。

任务简介

1、硅酸盐细菌的培养

2、胞外多糖的含量测定

3、胞外粗多糖的提取、纯化及酸水解

4、LC-MS分析单糖组分差异

一、硅酸盐细菌的培养

种子液制备时，以接种环挑取单菌落2-3环于有氮液体培养基（蔗糖2.0 g，酵母提取物0.1g，硫酸铵0.04g，MgSO4·7H2O 0.2g，碳酸钙0.1g，K2HPO4·12H2O 0.2g，pH 7-7.5）中，180r/min，30℃，摇床培养3天。发酵液培养基：配制添加7种不同矿粉的有氮培养基及不加矿粉的有氮培养基各200mL，接种量为10%（体积比），150rpm 30℃培养5天。

有氮液体培养基：

蔗糖（C12H22O11）10.0 g

酵母膏0.3 g

(NH4)2SO40.2 g

CaCO30.5 g

MgSO4·7H2O 1.0 g

K2HPO4 1.0 g

pH值7.0～7.5

蒸馏水 1.0 L

115℃高压蒸汽灭菌20 min

胶质芽孢杆菌荚膜观察：用胶头滴管在载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环从培养液中挑取少量胶质芽孢杆菌，与水滴混匀，涂成薄层，然后滴加10ul

10%刚果红溶液染色2min ，置于普通光学显微镜下观察细胞形态。

有氮固体培养基培养，放大1000倍

二、测EPS 含量

1、测蛋白质含量：用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。取1ml 发酵原液，加入4倍体积-20℃预冷的丙酮，4℃过夜。离心，烘干，加2ml 40mM Trise 在

80 ℃的水浴锅中加热溶解。8000 r/ min 离心10min 后取60ul 上清于96孔板中加180ulBradford 试剂，反应5min 后于595nm 测定蛋白质含量。

测蛋白标曲：

2、测多糖含量：用苯酚-硫酸法测定多糖含量。取1ml发酵原液(1ml单蒸水调零)，加3倍体积无水乙醇，4℃过夜。离心，烘干，加4ml水在80 ℃的水浴锅中加热溶解。8000 r/ min 离心10min后取1ml 上清,加6%苯酚0.5ml，浓硫酸2.5ml，静置10min，摇匀，室温放置20 min后，取200ul于96孔板中，于490nm测定吸光值。

测多糖标曲

三、纯化多糖：

将培养 5 d 后的发酵液在8000 r/ min 离心20 min ，取其上清液；将沉淀及少许液体合并后再次离心取上清液；合并两次上清液在 80 ℃的水浴锅中浓缩 ，体积减少至原体积的三分之一时 ，加入3倍体积的无水乙醇进行醇沉多糖 ，在4℃静止12 h 以后，4000 r/ min 离心

10 min ，收集沉淀，再分别用 95 %乙醇、无水乙醇，甲醇及乙醚洗涤沉淀，离心后得多糖粗品，即粗多糖。将该多糖粗品用20 mL 蒸馏水溶解后，用savge 试剂除蛋白5~7次后，再次醇沉离心得到较纯多糖，即纯化多糖。

酸水解多糖：用2M H 2SO 4在100℃下完全水解2小时，然后用碳酸钡中和（调Ph 为7）水解产物，4℃过夜。

四、LC-MS 定性定量分析单糖组分

用savge 试剂除蛋白：取粗多糖溶液4 ml ,氯仿—正丁醇(预先配制成体积比为4∶1 混合液) 溶液1 ml ,置于具塞试管中,充分振摇30 min 后,经离心机离心1 min ,然后将水相与氯仿相分开。将水相再加入相当于其体积1/ 4 的氯仿—正丁醇溶液,重复上述过程,共计重复5次。 Sevag 法较为温和，对多糖的结构影响不大，但效率较低，往往重复五次以上才能达到

理想效果。