枯草芽孢杆菌对几种植物病原真菌的抑菌活性

枯草芽孢杆菌对几种植物病原真菌的抑菌活性

杨晓燕;王钰鑫;叶伟伟;黄俊;张龙

【摘要】枯草芽孢杆菌是目前国内外比较具有应用潜力的生防菌种之一.本文主要研究了枯草芽孢杆菌菌液对几种植物病原菌的菌丝抑制试验、菌丝形态影响试验以及分生孢子萌发抑制试验,了解枯草芽孢杆菌菌液对尖孢镰刀菌古巴专化型、灰葡

萄孢、茄病镰刀菌、大丽轮枝菌、麦根腐平脐蠕孢、尖孢镰刀菌的抑制作用及抑菌机理.结果显示:枯草芽孢杆菌菌液对6种病原真菌的菌丝形态、菌丝生长、产孢和分生孢子萌发都有明显的破坏或抑制作用.用枯草芽孢杆菌菌液处理尖孢镰刀菌古

巴专化型、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、大丽轮枝菌、麦根腐平脐蠕孢、尖孢镰刀菌后,在PDA培养基上均形成了明显的抑菌圈,直径达3.00 cm左右;菌液处理后分生孢

子的萌发率仅30％左右.显微镜观察发现,处理组菌丝生长异常,体表凹凸不平,局部

膨大,分枝变多,原生质体外泄.研究表明枯草芽孢杆菌菌株对尖孢镰刀菌古巴专化型、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、大丽轮枝菌、麦根腐平脐蠕孢和尖孢镰刀菌有良好的抑制作用,并且可以有效控制尖孢镰刀菌古巴专化型、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、大丽轮

枝菌、麦根腐平脐蠕孢和尖孢镰刀菌病害的发生.

【期刊名称】《工业微生物》

【年(卷),期】2018(048)006

【总页数】7页(P32-38)

【关键词】枯草芽孢杆菌;菌丝抑制试验;菌丝形态;分生孢子萌发

【作者】杨晓燕;王钰鑫;叶伟伟;黄俊;张龙

【作者单位】山东劲牛生物科技股份有限公司,山东济南250000;山东劲牛生物科

技股份有限公司,山东济南250000;山东劲牛生物科技股份有限公司,山东济南250000;山东劲牛生物科技股份有限公司,山东济南250000;山东劲牛生物科技股

份有限公司,山东济南250000

【正文语种】中文

我国是农业大国，农业生产对中国经济的发展起着决定性的作用。尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、茄

病镰刀菌(Fusarium solani)、大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)、麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)这几种植物病原真

菌对农作物的危害较大，一旦发病则大量减产，给农业生产带来巨大的经济损失。Fusarium oxysporum f.sp. cubense可以侵染香蕉造成香蕉枯萎病，100多年来一直是香蕉生产的技术难题，属于一种毁灭性的病害，成为香蕉产业发展的巨大瓶颈[1-2]；Botrytis cinerea可以侵染多种蔬菜、水果和观赏植物的茎、叶、花和果实，寄主范围较广，危害较大[3]；Fusarium solani在多种植物上可以引起根茎腐病、枯萎病、根腐病等[4-5]，造成多种农作物和经济作物发生严重的病害；Verticillium dahlia可导致660多种双子叶植物发生黄萎病，对农业生产造成严

重的经济损失，其中包括多种重要农业作物大豆，棉花，玉米，草莓等；Bipolaris sorokiniana是小麦的整个生育期病害，病原菌可以侵染茎秆基部以及

根系，加快叶片衰老，引起小麦的倒伏，严重时造成枯白穗，轻者减产5%～10%，重则减产20%～50%[6]；Fusarium oxysporum侵染引起的枯萎病为毁灭性的土传病害，造成农作物严重减产甚至绝收。目前，国内外通常采用物理、化学及生物方法防治植物病害。物理防治费时费力，且防治效果有限、受环境条件影响较大，

因此应用受到限制；化学药剂由于其使用方便效果明显而被广泛使用，但长期大量使用使病害产生抗药性，造成环境污染、破坏生态平衡，且易造成农药残留，对人畜副作用大[7]；生物防治与其它方法相比，具有安全、有效和持久的特点，特别

是避免了化学防治带来的一系列问题[8-10]，近年来倍受关注。因此，更好地利用有益微生物防治植物病害是目前最为切实可行的策略之一。几十年来植物病害的生物防治微生物已涉及到真菌、放线菌、细菌乃至病毒(噬菌体)等多种种群。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在国内外已经被广泛用于防治多种植物病害且很多已经商品化生产，是自然界中广泛存在的不污染环境，对人畜无害的非致病细菌和植物内生细菌，具有较强抑制植物病害的能力；其抗逆能力强、内生芽孢、繁殖速度快、营养要求简单和对农作物安全，可以产生细菌素、酶类、活性蛋白质类、脂肽类和多肽类等多种抗菌物质[11]。其具有高效广谱的抑制植物病原菌的作用，包括根部病害、枝干病害、叶、花部病害和收获后果品病害等，且不易产生抗药性，能够促进植物生长等，是一种理想的生防微生物[12]。枯草芽孢杆菌对于开发用于微生物菌肥和农药具有非常大的应用潜力。本文主要研究枯草芽孢杆菌对几种植物病原菌的抑菌活性及其抑菌机制，通过抑菌试验研究其对植物病原菌的抑菌效果，通过被菌液处理过的孢子萌发和菌丝形态变化揭示其生防效果及抑菌机制，为该菌株作为生防菌的进一步开发应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试枯草芽孢杆菌菌株，于-80 ℃下保存在含20%甘油的LB培养基(胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母粉5 g，蒸馏水1 000 mL)中和固体LB培养基试管斜面上。试验时在固体LB(胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母粉5 g，蒸馏水1 000 mL，固体加入18 g琼脂粉)培养基平板上划线活化，用接种环挑取新鲜单菌落接入含有50 mL液体LB的250 mL三角瓶中，于37 ℃、200 r/min条件下振荡培养72 h，

4 ℃下保存，备用。

Fusarium oxysporum f.sp. cubense, Botrytis cinerea, Fusarium solani, Verticillium dahlia, Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum均来自实验室保存菌株，用固体PDA(马铃薯200 g，葡萄糖18 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1 000 mL)培养基繁殖培养，斜面保存于4 ℃冰箱。

1.2 枯草芽孢杆菌菌株的拮抗效果观察

1.2.1 枯草芽孢杆菌菌液对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用

采用牛津杯法[13]。在PDA平板上距中心2.5 cm的对称位置接种2块直径为5 mm的菌饼，平板中心放置1个内径为6 mm的牛津杯，杯内分别加入200 μL

菌液原液及其10、50、100倍稀释液，每个试验3个重复，置于25 ℃恒温培养

箱内黑暗培养；以灭菌的LB液体培养基为对照。培养5 d，测定抑菌圈直径，观

察实验结果，拍照记录。

1.2.2 枯草芽孢杆菌菌液对植物病原真菌分生孢子萌发的影响

将Fusarium oxysporum f.sp. cubense, Botrytis cinerea, Fusarium solani, Verticillium dahlia, Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum接种于PDA

培养基上，25 ℃恒温培养7 d后，用无菌水洗脱孢子，孢子悬液经Miracloth过滤去除菌丝碎片，慢速离心，清洗两遍后得孢子悬液[14]。取50 μL孢子悬浮液滴加于1.8%水琼脂培养基上，涂布均匀，再分别滴加50 μL枯草芽孢杆菌菌液及其10、50和100倍稀释液，每个试验3个重复，以滴加灭菌LB液体培养基为对照。涂布均匀后置于25 ℃下黑暗培养6 h和24 h。于6 h时在40×物镜下镜检，一

个视野镜检孢子60个左右，统计萌发孢子数，分别按公式计算萌发率和抑制率，并观察24 h时孢子的萌发情况。

分生孢子萌发率

1.2.3 枯草芽孢杆菌菌液对植物病原真菌菌丝形态的影响