环境中霉菌的检测

环境微生物的检测

一、实验目的

1.设计某一环境微生物的检测方案

2.完成环境中微生物分离与纯化

3.完成霉菌的初步鉴定

4.菌种转接保存

二、实验原理

在我们周围的环境中存在着种类繁多的、数量庞大的微生物。由于它们

体积微小，人们用肉眼无法观察到它们个体的存在。因此，我们可以取

少量样品在实验室用培养基培养微生物，以检测其中的微生物种类和数

量。培养基是用人工配制的、适合微生物生长繁殖和产生代谢产物用的

混合养料。其中含有微生物所需要的六大营养要素：碳源、氮源、无机

盐、生长因子、气体和水分。此外，根据不同的微生物的要求，在配制

培养基时还需用酸液或碱液调节至适宜的pH。配制好的培养基必须进行

灭菌。灭菌的方法较多，广泛使用的是高温灭菌，其中最常用的是高压

蒸汽灭菌法和干热灭菌。高温灭菌的条件是0.1MP a，121℃，20-30min。

干热灭菌条件是160-180℃，1-2h。为了确保纯种不被杂菌污染，在整

个接种过程中，必须进行严格的无菌操作。在实验过程中必须牢固树立

无菌概念，经常保持实验台及周围环境的清洁，严格无菌操作，避免杂

菌的污染，这是保证实验成功的必要条件。

三、实验材料

防火通道的土壤（取腐殖质丰富的地方的土壤，在多处地方取），自己用

馒头培养的霉菌。

四、实验器材与试剂

1.器材：刻度吸管、锥形瓶、电炉、酒精灯、火柴、无菌棉签和记

号笔。

2.试剂：马丁氏培养基：:KH2PO4、MgSO4•7H2O、蛋白胨，葡萄糖，

1%孟加拉红，琼脂，1%链霉素。

另外还需无菌水。

五、实验步骤

第12周

1.玻璃器皿的包扎，无菌水的制备

刻度吸管：1ml 16个，0.5ml 6个，10ml 2个。

培养皿：22个

无菌水：250ml锥形瓶含玻璃珠（20-30个）90ml蒸馏水 3 个、

1.8*18cm试管装9ml蒸馏水 16 个。

2.灭菌处理。

第13周

马丁氏培养基的制备

1.先计算后称量，按用量先称取各成分（K2HPO4 0.9g、

MgSO4*7H2O 0.45g、蛋白胨4.5g、葡萄糖9g、水900ml），

然后依次溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，

补充水分到所需体积。混匀后。

2.把上述培养基分为三部分，其中两个加入孟加拉红每100ml 加0.33ml。调PH值到4.0-5.8.其中一个继续加热加入琼脂使其融化，另外两个锥形瓶把琼脂加入液面下即可。

3.链霉素的配置：配置1%的链霉素10ml。

4.分装，把琼脂融化的培养基分装到八个试管里。包扎灭菌

5.链霉素加入，链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降低至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液（配好的链霉素溶液保存于零下20℃），在100ml培养基中加1%链霉素0.3ml。使每毫升培养基中含链霉素30ug。将上述加好链霉素的培养基加入到22个培养皿中。

第14周

样品的处理、接种、培养

一、样品的选择和处理：

1.从防火通道选取土壤，取5-10cm深的土壤。多选几个落叶

多的地方取土。可以稍微多取一点，以1:10的比例制成菌悬液20ml。

2.取已经长好霉菌的馒头的富含霉菌的位置，将其弄碎，以

1:50的比例制成菌悬液。

二、斜面培养：

1.用1ml刻度吸管吸取1ml原液到9ml的无菌水试管中，形

成10倍稀释，然后在吸取10倍稀释的样品1ml，到9ml

无菌水试管中，形成100稀释，以此类推，依次形成

10,102,103，104，105,106，107，108 稀释。样品自来水也

是如此进行稀释。

2.从稀释好的两种样品中取各自108 、106、104 倍稀释样

品，用接种环轻轻沾取少量样品接种到各三个斜面培养基

上。放置培养箱培养一周。（接种方法：教材022页）

二、平板划线法：

1.将上述10¹的试管中的菌液用接种环接种到培养基上。方法如图

三、稀释涂布平板法：

将一中的稀释好的两种样品中取各自108 、106、104 倍稀释样品0.1ml，加到培养皿中，用玻璃涂棒涂抹均匀。（方法见实验微生物生长量测定。）

培养：将上述的培养基放在恒温箱中培养，温度25-28°培养7天。（考虑其是用营养体培养，所以需要2-3天的培养时间，观察五天，是因为真菌在在5天内逐渐由营养繁殖，过渡到孢子繁殖菌落形态逐渐显现，当菌落形态没有定性时，不要盲目断定菌种。）

第15周

观察

取出培养好的培养基，并且观察两个样品在三个不同稀释度下霉菌的生长情况以及用平板划线法分离的菌落。并得出相应的实验结果，根据在显微镜下的观察（使用直接制片法观察见教材56页，即霉菌形态观察实验）检测相应环境中是否有霉菌

生长，同时根据在镜下的形态区分为何种霉菌。