《环境微生物学》实验四 细菌的染色和细菌细胞构造的观察
2.1微生物的染色及观察.
3、中性（复介）染料酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性（复合）染料, 如瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等,后者常川丁•细胞核的染色。
仁单纯染料这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质牛成盐, 英染色能力视K是否溶丁被染物而定，内为它们人多数都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如紫丹类（Sudani））的染料。
甲染色法过程：（1）制片在于净的载玻片上漁上一小滴蒸饬I水，用接种环进行无歯操作，挑収培养物少许，概水滴中，打水混合做成想液并涂成直径约1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，町在载玻片■侧再加-滴水，从已涂布的菌液中再収■环于此水滴中进行稀释. 涂布成薄层，若材料为液体培养物或W体培屛物中洗卜-制备的I為液，则点接涂布丁•栽玻片上即可. >（2）自然「燥涂片最好在电温卜•使其n然干燥，为了干得快些，町将标本mi向I.. T持娥玻片一端小心在酒灯高处微微加热，便水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标木烤枯而变形。
(4) 染色：标本固定后•渝加染色液•约1・3分钟。
注：个涂片(或仃标本的部分)戒该浸染料Z 屮。
2、复染色法(革兰氏染色法)(1)革兰氏阳性凿和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上仃很多 差别，染&反应不一样。
现在一般入为革兰氏阳性苗休内含有特殊的 核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢， 不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染 色反应的主要依据。
(2) 阳杵菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH 条件下进行染色， 阳竹：1為吸附«件染料｝R^；. W 此不易脱去，阴件菌则相反。
所以染色 时的条件要严控制。
例如：在强碱的条件下进行染色，两类曲吸附碱性染料都多，都町 呈止反应；PH 很低时，则町都泉负反应。
(3) 两类菌的细胞瓏等对结品紫-碘复介物的通透件也不一致，阳性 闲透性小，故染色液 集色结果 特点右•碳酸复纣 菌体呈.红色 若色快，时间短美兰菌体呈兰色 若色慢，时间长，效果淸晰 堂酸铁酹体呈紫色染色迅速，着色深•水单染色过程：涂丿 ---- 固定 (5 )镜检11 12 13(3) 复染过程：(1) 制片——撫一定 (2) 脱色・初染(见询)腮蟄瞬臨•能霜淪豳瞬熾??结介的稳定与不被 革氏染&4)水洗掘療觀獄!嗪W 粼r<6)镜检：I ：燥后的标木对用显微镜观察•细槽呈现第一次染色的效果紫色,< 兰氏阳性菊(Q±)oO<<呈现第二次染色的效果红色-称革兰 氏阴性菌(GOM •・，.7 :性厂；(b 用Attajt3用•霁耳《・■«*«»«««片上 M ）冲洗(•革兰氏染色法■■色 nn■•«□ »»细菌呈现第一次染色的效Q 色，革兰氏阳性gf (G»•呈现第二次染色的效果红色，称革兰氏阴性菌(3'补V 'y z# ■s Jv • A 1 c。
微生物学实验报告——细菌的染色观察
Report of Microbiology ExperimentSmears, Simple Staining, Gram Staining and Structural StainsXXX 2012/3/25 Shandong UniversityPurpose1.Understand the rationale and procedure of all the staining methods.2.Perform and interpret all the stains.3.Learn the shapes and structures of bacteria in deep.Background1.Smear PreparationSmear is to place a thin film of bacterial cells on a slide. The smear must be fixed to kill the bacteria; coagulated proteins from the cells will cause cells to stick to the slide. Fixing denatures bacterial enzymes, preventing them from digesting cell parts, which cause the cell to break. Fixing also preserves microbes with minimal shrinkage or distortion when stained.2.Simple StainStaining procedures use only one stain are called simple stains. The dyes are usually salts composed of charged colored ions. If the chromophore is a positive ion, the stain is considered a basic stain; if it is a negative ion, it is an acidic stain.Most bacteria are stained when a basic stain permeates the cell wall and adheres by weak ionic bonds to the bacterial cell, which is slightly negatively charged.3.Gram StainGram stain is a stain that classifies bacteria as either gram-positive or gram-negative.Bacteria differ in their rate of decolorization. Those decolorize easily are referred to as gram-negative, whereas those that decolorize slowly and retain the primary stain are called gram-positive. This difference is because of the chemical and physical differences in bacteria’s cell wall. Gram-positive cell walls contain multiple layers of peptidoglycans which gram-negative cells only have a thin layer.When decolorized by alcohol, the crystal violet in gram-positive cells cannot be washed out because of the compact peptidoglycan. So there will be different colors for different bacteria. When bacteria die, their cell walls degrade and may not retain the primary stain, giving inaccurate results.4. Structural StainsStructural stains can be used to identify and study the structure of bacteria when there is no electron microscope.Endospores are “resting bodies” of several genera of bacteria. They do not metabolize and are resistant to heating, various chemicals, and many harsh environmental conditions. To know whether a bacterium is an endospore-former and also the position of the endospores is helpful. Endospores are impermeable to most stains, so heat is usually applied to drive the stain into the endospore.Once stained, the endospores do not readily decolorize.Flagella are thin proteinaceous structures that originate in the cytoplasm and project out from the cell wall. They are very frafgile (usually 20-50nm) and arenot visible with a light microscope. But when they are coated with a mordant, which increases their diameter, they can be seen with light microscopes.The presence and location of fragella are helpful in identifying and classifying bacteria. There are two main types of fragella: peritrichous and polar.MaterialsCompound light microscopesSlidesInoculating loopAlcohol burnerAbsorbent paperMethylene blue(simple stain)Gram-staining reagents(Crystal violet, Gram’s iodine, Ethanol, Safranin)Endospore stain reagents(Malachite green and Safranin)Flagella stain reagents(A and B)Distilled waterCulturesEscherichia coli slantStaphylococcus aureus slantBacillus subtilis slant(24h&72h)Clostridium sporogenes slant(24h&72h)Pseudomonas aeruginosa slantProcedureⅠPreparing smears1.Clean the slides.2.Put a drop of distilled water on a slide.3.Sterilize the inoculating loop.ing the cooled loop, scrape a small amount of the culture off the slant andemulsify the cells in the drop of water.5.Let the smears dry.6.Pass the slide quickly through the blue flame with smear side up two or threetimes.ⅡSimple Stain(E.coli,S.aureus and B.subtilis)1.Prepare smears.2.Cover the smears with Methylene blue and leave them for about 1min.3.Gently wash off the Methylene blue with water.4.Blot the slides dry and examine stained smears microscopically.ⅢGram Stain(E.coli,S.aureus and B.subtilis)1.Prepare fixed smears.2.Cover the smears with crystal violet for 1-2 min.3.Gently wash off the Crystal violet with water.4.Cover the smears with Gram’s iodine for 1 min.5.Gently wash off the Gram’s iodine with water.6.Decolorize the smears with ethanol.7.Gently wash off the ethanol.8.Cover the smears with safranin for 2 min.9.Gently wash off the safranin.10.Blot the slides dry and examine stained smears microscopically.ⅣStructural StainsThe endospore stain(B.subtilis and C.sporogenes(24h&72))1.Prepare fixed smears of bacteria.2.Place a piece of absorbent paper over the smears.3.Cover the paper with Malachite green.4.Steam the slides for 5 min.5.Wash the smears with water.6.Cover the smears with Safranin for 2 min.7.Wash the smears with water and blot them dry.8.Examine stained smears with a microscope.The flagella stain(B.subtilis, E.coli and P.aeruginosa)1. Place a drop of distilled water on a side of a slide.2. Lightly touch the drop of water with the bacteria without touching the slide.3. Tilt the slide so the drop will flow to the opposite side of the slide.4. Allow the slide to air dry.5. Cover the dried smear with dye liquor A for 5 min.6. Gently wash off the dye liquor A with distilled water.7. Gently wash the slide with dye liquor B until brown color appears.8. Wash the smears with water and blot them dry.9. Examine stained smears with a microscope.ResultsSimple stainE.coli 1000×S.aureus 1000×B.subtilis 1000×Gram stainE.coli and S.aureus 1000×Unknown bacteria 1000× Gram positive & gram negative bacillusUnknown bacteria 1000× Gram negative bacillusEndospore stainB.subtilis 1000× Central, swollen endosporesC.sporogenes 1000× 24h Terminal, swollen endosporesC.sporogenes 1000× 72h Free endosporesFlagella stainB.subtilis 1000× Peritrichous flagellaE.coli 1000× Peritrichous flagellaP.aeruginosa 1000× Monotrichous flagellumRethink1.The microscopes should have a blue optical filter in the condenser to make surethe blank filed is white. That will be helpful to recognize the color of different stains.2.Heat-fixing is important in smear preparation to keep the shape of cells. Whenperforming flagella stains, I found that many bacterial cells looks larger than their normal size in the field. It may because of autolysis when cells die.3.When performing a Gram stain, the time of decolorizing should be handle toprevent excessive decolorizing.4.When performing flagella stains, violent shaking should be avoided to prevent theflagella from coming off. According to my results, bacteria with few flagellas will easily lose their flagellas when being stained.此实验报告存在一部分小错误和疏漏，比如个别的语法错误、用词不当，裁剪的图片未标明比例尺等。
细菌的染色方法和细胞形态结构的观察
实验二细菌的染色方法和细胞形态结构的观察姓名：马天柔学号：120109112 日期：2014/03/30一·目的：1了解生物染色的一般知识。
2学习细菌的涂片，染色的基本技术，并掌握细菌的简单染色方法和革兰氏染色法。
3通过染色观察细菌细胞的形态和结构。
二·染色的一般知识：细菌个体不仅十分微小，而且是无色半透明的，在明视野显微镜下很难看的清楚。
因此，要借助不同的染色方法，使细菌细胞或某些结构着色，与背景形成明显反差。
染色的标本不仅在显微镜下易于观察，还有鉴别细菌不同的细胞结构的作用。
三·细菌的革兰氏染色法（一）1器材：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子，接种耳，蒸馏水，香柏油，酒精，火柴，吸水纸，擦镜纸。
2结晶紫染色液，碘液，95%酒精，番红染色液。
3大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。
（二）步骤：涂片-干燥-固定-结晶紫染色1min-水洗-碘液煤染1min-水洗-95%酒精脱色20-30s-番红染色4-5min-水洗-干燥-镜检1涂片：用镊子取浸泡在酒精中干净的载玻片，烧去酒精，在玻片中央加一滴清水，通过无菌操作方法从斜面上分别挑取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌和清水滴混合均匀。
2干燥：涂片可让其在室温下干燥，必要时可将涂片朝上，小心的在酒精灯火焰高处稍烘，以助水分蒸发，快速干燥。
但切勿靠近火焰，将标本烤焦。
3固定：一般常采用加热固定法，即手持玻片一端，涂片朝上，在火焰外层通过3-4次，以玻片反面触及皮肤不觉得太烫为度。
待冷却后，在进行染色。
4染色:待固定涂片完全冷却后，在涂面上滴加染色液，染色液要布满整个涂面。
5水洗：染色时间到后，倾去染色液，斜置载玻片，用干净的细流水冲去多余的染料。
6干燥：用吸水纸吸取玻片上的水分，让其自然干燥。
7镜检：用油镜观察，并记录观察结果。
油镜下观察的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（100×10）四·心得体会：老师看了我染色后的标本后说班里的第一个模板出来了，心里是很高兴的，我按照步骤一步步染色，还算是染的均匀。
实验二 细菌的染色和细菌细胞构造的观察
Colonies of Beijerinckia species growing on a carbohydrate-containing medium
思考题
• 荚膜负染法为什么不用热固定？ • 为什么包在荚膜内的菌体着色，而荚膜
不着色？
• 简约流程
制片――干燥（空气中晾干或用冷风吹干 ――复红染色液染色3-5min――水洗―― 干燥（晾干）――涂苯胺黑（薄层）―― 风干――镜检――记录
实 验 2-1 结束
染色简约流程
• 荚膜染色 制片――干燥（空气中晾干或用冷风吹干 ――复红染色液染色3-5min――水洗――干 燥（晾干）――涂苯胺黑（薄层）――风干 ――镜检――记录
• 观察：背景、菌体、荚膜、细菌形态等， 并绘图。
Free-Living Aerobic Nitrogen-Fixing Bacteria
• Large, gram-negative, obligately aerobic rods, capable of fixing N2 nonsymbiotically • Azotobacter has the highest respiratory rate of any living organism (purple bacteria) • Azotobacter cells are very large, almost the size of yeasts, produce cysts
• 芽孢染色 涂片－－干燥－－固定――5%孔雀绿水溶 液，加热至染液冒蒸汽，约维持5min（勿干） ――冷却――水洗――番红液染色1-2min ――水洗－－晾干或吸干――镜检――记录
实验 细菌的染色.ppt
复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有：
革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 荚膜染色法等。
2019-9-15
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革兰氏染色（Gram stain） 1984年，丹麦医生Gram采用革兰氏染色法细 菌细胞壁区分为两种类型：革兰氏阴性（G+） 和革兰氏阳性（G-）
2) 油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净， 否则可能损害镜头
3）擦油镜镜头方法：分三步 A）先用擦镜纸揩去 镜头上的香柏油 B）从双层瓶的下层沾少许二 甲苯滴在另一片擦镜纸上 ，擦拭镜头； C）再用 一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。
2019-9-15
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2、革兰氏染色
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及 它的特殊构造等。
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思考题
简单染色:
(1) 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节? (2) 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、
时间太长，又会怎样呢？
革兰氏染色: (1) 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节
是什么? (2) 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆茵的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰
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2、干燥 室温自然干燥
操作步骤（continued）
3、固定
固定的目的： 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态； 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。
固定方法： 热固定：涂面朝上，通过火焰数次 注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态
2019-9-15
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实训四 细菌的染色和形态观察
实训四细菌的染色与形态观察一、实验目的1、学习细菌涂片技术和无菌操作技术；2、掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征；3、了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法；4、进一步熟练显微镜的使用。
二、实验原理细菌个体微小，无色且较透明，折射率低，在普通光学显微镜下不易识别，因此必须借助染色法使菌体着色，将其折射率增大，使其与背景形成明显的色差，在显微镜下用油镜观察，可清楚观察到细菌的一般形态结构及特殊结构。
根据细菌个体形态观察的不同要求，可用简单染色法或革兰氏染色法进行染色观察。
（一）简单染色法简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料进行细菌染色的方法。
此法操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察，但不能辨别细胞的构造。
常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使其着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。
常用的简单染色染料有草酸铵结晶紫染液、吕氏碱性美蓝（亚甲基蓝）、石炭酸复红染液等。
（二）革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学上最重要的鉴别染色法。
由于细菌细胞壁的化学组成和结构不同，经革兰氏染色后，呈现不同的染色反应，可将所有细菌区分为两大类：革兰氏阳性细菌（染色反应呈蓝紫色），用G+表示；革兰氏阴性细菌（染色反应呈红色），用G-表示。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，脂类含量低。
在染色过程中，用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈现蓝紫色。
革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，脂溶剂乙醇溶解脂类物质，使得细胞壁的通透性增加，结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
《细菌的染色及观察》课件
记录与分析
详细记录观察结果，并 对异常形态的细菌进行 分析，提高实验的可靠
性。
实验后的清理
清洁工作台
实验结束后，对实验台面进行 彻底清洁，去除残留物。
废物处理
按照实验室规定正确处理废弃 物，防止对环境造成污染。
仪器归位
将使用过的显微镜、载玻片、 盖玻片等仪器归位，方便下次 使用。
总结与反思
对本次实验进行总结，反思实 验过程中的不足之处，以提高
污水处理效果。
环境污染评估
染色技术可以用于评估环境中的 细菌污染状况，为环境保护提供
科学依据。
生态平衡研究
染色技术可以用于研究生态系统 中细菌的作用和平衡，了解生态
系统的运行机制。
05
实验操作注意事项
实验前的准备
实验材料准备
确保所有实验材料齐备，包括细菌培养物、染色 液、显微镜、载玻片、盖玻片等。
04
细菌染色技术的应用
在医学上的应用
诊断疾病
通过细菌染色技术，医生可以准 确诊断感染性疾病，如肺炎、肠 道感染等，为患者提供及时有效
的治疗。
抗生素敏感性测试
染色技术可以用于测试细菌对抗生 素的敏感性，帮助医生选择合适的 抗生素进行治疗。
病原体追踪
在传染病爆发时，染色技术有助于 追踪病原体的传播途径和来源，为 防控措施提供依据。
《细菌的染色及观察》ppt课件
目录
• 细菌染色技术简介 • 细菌的染色过程 • 细菌的观察方法 • 细菌染色技术的应用 • 实验操作注意事项
01
细菌染色技术简介
染色的目的和原理
目的
使细菌能被肉眼或显微镜观察， 以便区分不同形态和特征。
原理
染色剂与细菌结合，改变细菌的 折光率和颜色，使其与其他物质 区分开来。
1、细菌的形态结构观察和染色
奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜
荧光发射装置 摄像头 双筒目镜 镜筒 镜臂 物镜转换器 物镜 电源 载物台 视场光阑 载物台调节钮
光强调节钮 粗调节器 细调节器 镜座 孔径光阑
奥林帕斯生物显微镜的使用方法
1. 2. 3.
4.
5.
6.
7.
8. 8. 9.
10. 接通电源。 打开主开关。 转动光强调节钮，使亮度适中。 把标本固定在载物台上。 11. 用低倍物镜，旋转粗调和微调 来进行对焦。 12. 调节双目镜筒间距和视度差。 再适当调节照明度。 使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 依次用低、中、高倍镜观察。 13.
实验一 结束
请交报告！
实 验 一
细菌的形态结构观察和染色
目的要求
观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理 及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽 孢、荚膜及鞭毛染色。 了解环境微生物的检查。
安全事项
微生物 酒精灯
灭菌锅
玻璃器皿
超净台（紫外线）
电器（电炉、微波炉…） ……
实验材料 Ⅰ
(一)菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
(二)染液
1. 2.
简单染色：草酸铵结晶紫染液。 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、 95％乙醇、蕃红染液。
实验材料 Ⅱ
(三)标本
细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。
(四)其他物品
无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、 吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。 肉膏蛋白胨培养基平板。
实验内容
（了解芽孢染色的方法和步骤）
孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴 水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀， 制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6％的孔雀绿 饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染液勿 使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5％蕃红液染色lmin， 水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈 现红色。
细菌的染色和细菌细胞构造的观察.
实验二细菌的染色和细菌细胞构造的观察染色是观察微生物的一种重要方法。
由于微生物细胞含有大量水分,一般在80%-90%以上,对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,与周围背景没有明显的明暗差。
所以,除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外,绝大多数情况下都必须经过染色后,才能在显微镜下进行观察。
一、目的要求1. 学习微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
2. 掌握细菌的一般染色法和革兰氏染色法。
3. 进一步熟练显微镜油镜的使用技术。
4. 观察和识别细菌细胞的特殊构造。
二、染色剂和染色的原理微生物染色的基本原理,是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。
物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。
细菌的等电点较低小pH值大约在2-5之间,故在中性、碱性或弱酸性溶液中,菌体蛋白质电离后带负电荷;而碱性染料电离时染料离子带正电荷。
因此,带负电荷的细菌常和带正电荷的碱性染料进行结合,所以在细菌学实验室中常用碱性染料进行染色。
染色剂是一种供染色用的有机化合物,当前普遍采用的染色剂是含有苯环的有机化合物,染料分子都由苯环、连接在苯环上的染色基团(或称呈色基团,色基和助色基因(或称作用基团三部分组成、助色基团具有电离特性,电离后带有正或负电荷的染料离子便能与细胞有较牢固地结合,使其呈现颜色。
染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质分为酸性染料、碱性染料、中性(复合染料和单纯染料四大类。
(1酸性染料这类染料电离后染料离子带负电荷、如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等,可与碱性物质结合成盐。
(2碱性染料这类染料电离后染料离子带正电荷、可与酸性物质结合成盐。
微生物实验室一般常用的碱性染料有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等,在一般的情况下,细菌易被碱性染料染色。
(3中性(复合染料酸性染料与碱性的结合物叫做中性(复合染料,如伊红、美兰等,瑞脱氏(Wright 染料和基姆萨氏(Gimasa染料等,后者常用于细胞核的染色。
细菌的革兰氏染色和形态观察
二、实验原理---简单染色
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不 易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对 细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明 显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列 的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中， 细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正 电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色 后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作 简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使 培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚 果红等酸性染料染色。
二、实验原理---革兰氏染色
当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂， 它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处 理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结 构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构 孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染 后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高， 所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比 较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。。
干燥
2.革兰氏染色
涂片：取清洁玻片一块，在玻 片两端1/4处下面用记号笔分别 标明S和E（见图示），并滴一 滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄 球菌和大肠杆菌涂布在相应的 区域内。
微生物的染色和形态观察
操作步骤
观察完毕。上升镜筒，转动物镜转换器， 4、观察完毕。上升镜筒，转动物镜转换器，使 油镜物镜偏位。 油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的 油迹，再取一张擦镜纸醮上二甲苯擦去镜头 油迹， 上残留的香柏油， 上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜 纸擦去残留在镜头上的二甲苯。 纸擦去残留在镜头上的二甲苯。 将显微镜各部分还原，放回箱中。 5、将显微镜各部分还原，放回箱中。
结果与分析
★结果 ——根据观察结果，绘细菌形态作图
思考题
（1）为什么要求制片完全干燥后才能用油镜 观察？ （2）如果涂片未经热固定会出现什么问题？ 如果加热温度过高、时间过长又会如何？
下一个实验
细菌的革兰氏染色和芽孢染色
基本原理
★细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法 使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便 在显微镜下进行观察。 ★根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴 别染色法和特殊染色法等。 ★简单染色法是最基本的染色方法，是利用单 一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适 用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
基本原理
操作步骤
六、镜检 ——必须完全干燥后才能用油镜观察 ★油镜使用原理及注意事项
操作步骤
操作步骤
低倍镜观察（寻找观察目标）。 1、低倍镜观察（寻找观察目标）。 高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 2、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒3、油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒-油镜 转至正下方，在载玻片上加一小滴油转至正下方，在载玻片上加一小滴油-小心地 下降镜筒使镜头浸在油里下降镜筒使镜头浸在油里-用粗螺旋将镜筒缓 慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节， 慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节， 使物象清晰-观察记录。 使物象清晰-观察记录。最大光圈
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• 染色：染色液必须新配制，涂片必须充分晾干才能染色。
1. 先用刚过滤的鞭毛染色液A染7.5—8min左右。 2. 倾去A液，再加鞭毛染色液B液染3—5min，水洗，自然干 燥。 ３.用Ｃ液石炭酸复红复染２min，水洗、晾干、镜检。 • 油镜下观察鞭毛的数目及着生情况（示范镜）并绘图 （菌体与鞭毛都呈红色，周生鞭毛）。
染色剂和染色原理Ⅱ
微生物染色常用染料如下表：
实验材料
• 涂片染色用的细菌培养物
１.大肠杆菌（Escherichia coli) 24h的斜面培养物。 ２.枯草杆菌（Bacillus subtilis) 12—16h的斜面培养物。
• 载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火柴、 无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。 • 显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。 • 示范片
• 微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。 物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作 用等。 化学因素如：正负离子之间的相互吸引等 • 染色剂 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型： 1. 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。 2. 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶 紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。 3. 中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染 料等（常用于细胞核染色）。 4. 单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物， 不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b)的染料。
细菌荚膜和负染色法
实验程序Ⅴ
（鞭毛染色的方法和步骤） • 菌液的制备及涂片：菌种应预先连续传代5—6代。 1. 接种：先在斜面底部加入0.5—1mL无菌水，取活化的枯草 杆菌1—2环菌苔，接种于无菌水中，300C 培养15—18h。 2. 制备菌液：挑取斜面底部近水面处菌苔数环，移入1mL与 菌种同温的无菌水中，在280C温箱中保温10min。 3. 鞭毛涂片：先用悬滴法观察其运动性，若运动性很强，即 可涂片。涂片后自然干燥、固定。
１.苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的芽孢； ２.胶质芽孢杆菌（Bacillus mucillaginosus）的荚膜； ３.枯草芽孢杆菌的鞭毛。
实验程序Ⅰ
（细菌染色的方法和步骤）
• 细菌染色的方法: • １.单染色法：用一种染色液染菌体后，就可以观察 微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴 别微生物以及它的特殊构造等。 ２.复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色， 有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常 用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 芽孢染色法、鞭毛染色法、细胞染色法等。 • 染色技术的一般过程
实验程序Ⅳ
（荚膜染色的方法和步骤）
• 荚膜染色法（示范）：荚膜薄，易变形， 因此在涂片过程中不能用加热固定。 1. 取斜面培养72h左右的胶质芽孢杆菌涂 片，自然干燥，自然固定。 2. 染色：在已自然晾干的涂面上，滴加 1%结晶紫染色液染色2min，以20%硫酸 铜冲洗数次，再用自来水冲洗1次，晾干。 3. 镜检：油镜观察示范片并绘图（菌体 红色，荚膜无色）。
TEM=透射电子显微镜
思
考
题
• 简单染色法中各步骤的注意事项是什么？ • 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意 哪些操作？关键在哪几步？为什么？
实 验 四 结 束
片 水洗 干燥 干燥 固定 镜检 染色 媒染 脱色 复染 涂
实验程序Ⅱ
（简单染色的方法和步骤） • 简单染色法（一般染色法） １.菌种：牙垢细菌 ２.涂片 ３.干燥：自然气干或酒精灯 高处微微加热。 ４ 固定 ５.染色：在整个涂面上滴加 齐氏石炭酸复红，染色１分 钟。 ６.水洗：倾去染液，用自来 水细流冲洗至流下的水中无 染料颜色为止。 ７干燥：空气中自然干燥。 ８ 镜检：在油镜下观察牙垢 中的各种细菌形态并绘图。
实验程序Ⅲ
（革兰氏染色的方法和步骤） • 革兰氏（Gram）染色法 1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加 草酸铵结晶紫染液，染1分钟， 倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘 液冲去残水，而后用其覆盖涂 面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加 95%酒精进行脱色约30秒，后 立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染1 分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。
实
验
四
细菌的染色和细菌细胞 构造的观察
细菌的染色和细菌细胞构 造的观察
• • • • • 目的要求 染色剂和染色的原理 实验材料 实验程序 思考题
目的要求
• • • • 学习微生物涂片 掌握细菌的一般染色发和革兰氏染色 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 观察和识别细菌细胞的特殊构造
染色剂和染色原理Ⅰ
革 兰 氏 染 色 法
• 1.涂片固定
2.单
染—结晶
紫染液第 一次染色
1min
4. 脱色—95%乙醇溶 液进行颜色洗脱
5.复
染—
红色 的藩
3.媒染—
碘-碘化钾
红染 液第
溶液浸湿
二次
染色
30S
细菌呈现第一次染色的 效果紫色，革兰氏阳 性菌（紫阳G＋）；
• 呈现第二次染色的效果 红色；称革兰氏阴性菌 （红阴G -）