药物检测常用色谱法

三、 高效液相色谱法的主要分离类型
（根据色谱柱填充剂不同） 1. 2. 吸附色谱（液-固吸附色谱）
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，
分配色谱（液-液分配色谱）
固定相一般为液体，依靠涂布、键合、吸附等手段分布 于色谱柱或者担体表面。
3.
键合相色谱
以化学键作为固定相（ C18
ODS）
4.
凝胶色谱（空间排阻色谱）以凝胶为固定相。
一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶剂按一定的比例 抽入高压泵中混合。
(2) 进样装置
通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
(3) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
(4) 检测器
专用型 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高 通用型 3）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格 4）电导检测器
A、理论塔板数：
（1）计算：
tR ) 2 16( t R ) 2 n 5.54( wh / 2 w
（2）规定：所测理论塔板数度不低于药典中该 品种规定。 （3）改善方法：改变柱长，改变固定相、柱填 充均匀、柱温等。
B、分离度：
TR2-tR1
(t R 2 t R1 ) R w1 w2 2
第三节 药物检测中常用色谱分析技术
一.概述
俄国植物学家茨维特在1906年使用的 装置：色谱原型装置，如图。 其中的一相固定不动，称为固定相；

另一相是携带试样混合物流过此固定
相的流体（气体或液体），称为流动相。
色谱法
［原理］:利用混合物中各组分与两相（流动相、固 定相）亲和力不同而分开。即利用物理或化学的方
2）进样器：六通进样阀（手
动）、自动进样器 3）色谱柱：（心脏） 4）检测器：常用紫外检测器 5 ）数据处理系统
2.主要部件 (1) 高压输液泵
主要部件之一，将液体的流动相以稳定的 流速或压力输送入柱系统。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调 、耐腐蚀等特性
梯度洗脱装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，将两 种不同极性的溶剂按一定的比例 送入梯度混合室，混合后进入色 谱柱。 内梯度:
规定 杂质峰面积总和/总峰面积≤20%合格
（4）主成份自身对照法（杂质）
1）不加校正因子 无杂质对照品，以供试品稀溶液为限量 对照溶液，比较杂质峰与对照液中的主峰面 积，粗略计算杂质的限量。
例《中国药典》中吉非罗齐的有关杂质检查
流动相 取5μl
供试品
（10mg/ml） 待测液
精密定量
进样 5μl
（2）内标法：
第一步：先用对照品（已知CR）和内标（已 知CS）混样进入仪器，求出 f As / CS
AR / CR
AR：对照品峰面积 CR：对照品浓度
AS：内标峰面积 CS：内标浓度
（2）内标法：
第二步：再用待测物（未知CX）和内标（已知CS）
CX AX f 混样进入仪器代入上公式： CS AS
t
五、气相色谱法与高效液相色谱法色谱参数

（2）保留时间tR：从进样到组分色谱峰顶点的时间 （3）峰高h：从最高点到基线的距离。 峰面积：色谱峰与峰底（或基线）所围成的面积
tR
h t
（0 .607h处） 五、气相色谱法与高效液相色谱法色谱参数


（4）峰宽W：拐点作切线在基线上的载距。W越 窄柱效高。 （5）半峰宽Wh/2点：峰高一半处的峰宽。
三、气相色谱工作流程
四、HPLC与GC的区别
1．分析对象的区别 GC： 适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品， 占有机物的80% 2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性气体 HPLC：流动相为液体 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压
色图谱(1) 色图谱(2)
对照液 （0.2mg/ml）
规定 所有杂质峰的面积和不得大于主峰的面积 （注：主成份浓度约0.02%，杂质不超过为合格）
2）加校正因子（有对照品）
待测液各杂质峰分别乘上校正因子后与对照品
主成份峰面积比较，分别计算各杂质含量。 a、测定校正因子
A主 / C主 f A杂 / C杂
注意：GC主要用于溶剂残留量检查、乙醇量测定 和挥发性杂质检查
六、色谱的应用
3、在鉴别中的应用：（利用保留时间）
在规定条件下测tR与文献对照
定性方法
把对照品和待测物分别做色谱，对比tR
加入已知对照品于混合待测物中，若某 组分峰显著增加即为该组分
2、定量方法（含量测定、杂质检查）
（1）外标法 （2）内标法 （3）面积归一化法（只测杂质） （4）主成份自身对照法（只测杂质）
2、点样与展开
点样线距离部位2.0cm
点样
点间距离1.5-2.0cm
点大小2-4mm 展开剂饱和展开缸
展开
展开剂深度0.5-1.0cm(不能浸没样点)密封
展开剂的规定距离(10-15cm)
取出板子，标好前沿，晾干
3、斑点定位
（1）组分有颜色 直接定位
（2）显色剂显色 通用显色剂 硫酸 (喷雾法) 专用显色剂(如茚三酮使氨基酸显色) （3）无合适显色剂 荧光板 定位
五、气相色谱法与高效液相色谱法色谱参数
（1）基线：没有样品进入检测器时，噪音随时间的变化。 色谱峰：当有组份进入检测器时，色谱流出曲线偏离 基线，这时检测器输出的信号（响应信号）随检测器中的 组份的浓度而改变，此时绘出的曲线称色谱峰。（色谱柱 流出组分通过检测系统所产生的响应信号的微分曲线）。
响应值
∴
CS CX f AX AS
CS 已知，f：已求出 AS Ax测出
（3）面积归一化法（杂质）
杂质峰占所有峰总面积中比例不超过一定数
值来限量。
杂质含量=（杂质峰面积/总峰面积） 100% 例：《中国药典》阿司帕坦中有关物质的检查： 样品 进样 流动相 （6mg/ml） 溶液 记录图谱
来自百度文库
取10μl


（加或不加校正因子）
（1）外标法：
待测物
精密 称量
配成溶液
注入仪器
色谱图 AX 色谱图 AR
精密 对照品 称量
配成溶液(CR)
注入仪器
C X AX CR AR
AX C X CR AR
（2）内标法： 内标物要求：
结构相似，待测样品中没有的组分。 出峰与待测组分相邻近，但能分开（R＞1.5） 纯度合乎要求的纯物质
h
Wh/2 W
0.5h
t
六、色谱的应用（定性、定量、杂质检查）
1、色谱条件的选择： 色谱柱、流动相、柱温、检测器、检测波长、流速等 2、色谱系统适用性试验 A、理论塔板数：n不低于药典中该品种规定。 B、分离度：R＞ 1.5或按药典规定 C、重复性：RSD≤ 2.0 % D、拖尾因子 ： 定量时T应在 0.95~1.05之间
b、测量
C X AX f CS AS
即
f AX CX AS / CS
AX—杂质峰面积 CX—杂质浓度 AS—对照液主峰面积 CS—对照液主成份浓度
I2蒸汽
4、检测
1、鉴别方法（或定性） 比移值(Rf) 组分的迁移距离与展开剂的迁 移距离之比称为比移值(Rf)
对比文献手册法
Rf是定性的依据
对照品法
（2）定量方法：
①挖掉斑点 → 溶剂萃取 → 过滤 → 蒸发
溶剂 → 称量
②薄层扫描仪：自动计算斑点面积：与已
知量的对照品对照
Ax — 待测组分斑面积 =
法将混合物组分分开然后进行鉴别、定量、杂质检
查的方法 。 ［用途］：用作药物的鉴别、含量测定、杂质检查等方面 ［特点］：高灵敏度，高选择性 高效率、应用范围广
2.色谱法分类
1)纸色谱和薄层色谱：比较简单的色谱方法
2).液相色谱：流动相为液体。
3).气相色谱：流动相为气体（称为载气）。
薄层色谱（TLC）
As — 对照品斑点面积
Mx — 待测组分的量 Ms — 对照组分的量
三、应用



1、作为柱色谱的先导试验，进行模拟和 条件优化 （吸附剂、洗脱剂、溶剂） 2、药物的鉴别 3、药物的杂质检查 4、药物含量测定：
例1：头孢拉定、头孢氨苄等头孢类的鉴别 硅胶G薄层板 展开剂：0.1m枸橼酸/0.2M磷酸氢二钠/丙酮(60： 40：1.5) 显色剂：0.1%的茚三酮溶液 规 定：供试品主斑点应与 样品 对照品

四、高效液相色谱工作流程
五、测定方法（实验课讲）




1、操作前的准备 A、流动相用什么试剂配制？水用什么水？ B、供试品溶液的配制。 C、配好的流动相和供试品溶液、对照品溶液 要经过怎样处理？ 2、具体操作
气相色谱法（GC）
气相色谱法
气-固色谱法
气-液色谱法
气相色谱法（GC）
一、气相色谱仪的结构
W1 W2
规定R＞1.5或按药典规定。
C、重复性 取对照品溶液连续进样五次，其峰面积 RSD≤2.0%
D、拖尾因子
W0.05：峰高0.05处峰宽
W0.05 h T 2d1
d1：峰高0.05处出峰极大到峰前沿的距离
规定：除另有规定外，定量测定时T应在 0.95~1.05之间
六、色谱法的应用
定性（鉴别） 3、色谱法的应用 杂质检查：限量检查 定量（含量测定）
一、薄层色谱的构成
（1）薄层板：5×10cm等硅胶、氧化铝板
（2）点样器 （3）流动相—展开剂
（4） 层析缸 应密闭用蒸汽饱和
单一溶剂 混合溶剂
（5）显色剂 （6）检视装置
二、实验步骤
1、薄层板的制备（5×20cm，10×20cm）
水
硅胶G
糊状 活化
均匀铺层
室温干燥
加热110℃ 30min
干燥保存
对主斑点一致
四、注意事项



1、活化 2、点样量（≤ 10ｕl) 3、点样速度快（≤ 10min) 4、温、湿度 5、避免边缘效应
高效液相色谱法（HPLC）
一、按两相所处的状态分类 液相色谱法 液-固色谱法
液-液色谱法
二、高效液相色谱仪
1、高效液相色谱仪的结构
1）高压输液系统：高压泵等
由六大系统组成： 气路系统（氮气） 进样系统 分离系统 控温系统 检测系统 记录（数据处理）系统
二、气相色谱检测器的类型



浓度型检测器：如热导池检测器（TCD）和电子捕获检测器 常用 （ECD） 质量型检测器：如氢火焰离子化检测器（FID）和火焰光度检 测器（FPD）、氮磷检测器（NPD） 通用检测器有： 1、热导池检测器（TCD）测一般化合物和永久性气体 2、氢火焰离子化检测器（FID） 测一般有机化合物 专用检测器有： 3、电子捕获检测器（ECD） 测含卤素化合物 4、火焰光度检测器（FPD）测含硫、含磷的有机化合物 5、氮磷检测器（NPD）测含氮、含磷的有机化合物