最新实验二 可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝G-250法)上课讲义

实验步骤
1.标准曲线的绘制 0～100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表-1数据配 制0～100μg/ml血清白蛋白液各2ml，加入5ml考马斯亮蓝 G-250试剂，盖塞，混合均匀，放置2min后，在30摄氏度 水浴 10min，在595nm下比色，绘制标准曲线。
表-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液
0.35
Y=-0.00381+0.032029*X 0.30 r=0.9992
0.25
Absorbance
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00 0
2 4 6 8 10
Protein content ( g)
注意事项
1 由于取的组织不同，所以 OD值相 差较大。
2 研磨须充分，否则溶解后析光时所 得数据并不是1克植物量对应值。
实验二 可溶性蛋白质含量 的测定(考马斯亮蓝G-250
法)
实验目的
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类， 测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每 一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表 示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性 蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
3 标准溶液的测定实验组同时进行， 以免引起误差。
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蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内 达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含 量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。
实验器材和试剂
实验仪器： 分光光度计 分析天平 样品 容量瓶 移液管 试管
实验材料：植物叶片
实验试剂
标准牛血清蛋白 溶液
染料试剂G-250
试剂的配制
牛血清白蛋白： 配成100μg/ml； 考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-
250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V） 磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此 溶液在常温下可放置一个月； 90%乙醇； 磷酸（85%，W/V）。
管号
123456
100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸馏水量(ml)
2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
蛋白质含量(mg)
wenku.baidu.com0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20
实验步骤
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
取植物叶片0.3-0.5剪碎，用磷酸缓冲液研磨，倒入 25ml 容量瓶中，定容到25 ml，取一定体积的样品液 于10ml离心管中，注意两组之间平衡，10000 pm离 心，10min 得上清液作为待测样品。
取1.0 ml提取液于试管中，加入1.0ml蒸馏水后摇匀， 再加上5 ml考马斯亮兰试剂并充分摇匀，在30摄氏度 水浴 10min ，于595nm处测得OD值。
可溶性蛋白质含量的计算
可溶性蛋白含量 (μg/gFW)=标准曲线上查得 的蛋白质量（ μg ） × 25/（0.3-0.5）
示意如下：
实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的 一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与 蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内 （0～100μg/ml），蛋白质与色素结合物在595nm波 长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质 的定量测定。