质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

质粒ＤNA得提取、定量、酶切与ＰＣＲ鉴定

一、实验目得

１、学习并掌握用碱裂解法提取质粒ＤNA得方法;

2、学习并掌握了解质粒酶切鉴定得方法;

３、学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度得原理与方法;

4、学习并掌握PＣR基因扩增得实验原理与操作方法；

5、学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳得原理与使用方法.

二、实验原理

1、PCR（多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板,以特定引物为延伸起点,以ｄNTＰ为原料,通过变性、退火、延伸等步骤, 在体外(缓冲液中）复制DＮA,使目得DNA按２ｎ方式呈指数形式扩增。

PＣR一次循环得具体反应步骤为：

A、变性：加热反应系统至9５℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

Ｂ、退火:逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温（3５—70℃，一般低于模板Tm值得５℃左右）,与模板DNA互补退火形成部分双链.

C、延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Ｔaq酶作用下，以dNＴP为原料,引物为复制起点，模板DＮA得一条单链在解链与退火之后延伸为一条双链。

2、质粒DNＡ得提取与制备

(1)、碱裂解法：

染色体DNＡ与质粒DNＡ得变性与复性存在差异:

A、高碱性条件下，染色体DNA与质粒DNA均变性;

B、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性得质粒DNＡ复性并保存在溶液中,染色

体ＤNA不能复性而形成缠连得网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

（２）、离心层析柱：

Ａ、硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中得质粒ＤNA，而不吸附溶液中得蛋白质与多糖等物质；

B、通过去蛋白液与漂洗液将杂质与其它细菌成分去除;ﻭ

C、低盐，高ｐH值得洗脱缓冲液将纯净质粒ＤNＡ从硅基质膜上洗脱.

3.质粒DＮA得定量分析（紫外分光光度法):

A、物质在光得照射下会产生对光得吸收效应，且其对光得吸收就是具有选择性；

B、各种不同得物质都具有其各自得吸收光谱：

DNA分对波长260nm得紫外光有特异得吸收峰

蛋白质对波长２80nm得紫外光有特异得吸收峰

碳水化合物对23０ｎm得紫外光有特异得吸收峰

C、A260/A2８0及Ａ２６0／A23０得比值可以反应DNA得纯度;

A2６0／Ａ２８0＝1、８DＮＡ纯净

A２６０/A２80＜1、8 表示样品中含蛋白质(芳香族)或酚类物质

A26０/A280〉1、8 含RNA杂质,用RＮA酶去除。

4.质粒ＤNA得酶切鉴定:

限制性内切酶就是DNA重组操作过程中所使用得基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列得特殊ＤNA序列结合，或就是与其附近得特异位点结合,并在结合位点切割双链DNA。

5.琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖就是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性得滤孔，凝胶孔径得大小决定于琼脂糖得浓度.

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNＡ分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应：不同得DNA，分子量大小及构型不同,电泳时得泳动率就不同，从而分出不同得区带（迁移速度与分子量得对数值成反比关系）、

三、材料与方法：

（一）实验材料：

1、PＣR

仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌得薄壁离心管

材料：菌液【大肠杆菌DH5ａ菌株（pMD19-Ｔ质粒,含目得片段－绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、２×Pｒemix Taq、引物

2、质粒DNＡ得提取与制备

仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendｏrf管、微量加样枪、离心管

材料：溶液Ｐ1(S1）、溶液P2（S2)、溶液P3（S３）、去蛋白液PE（Ｗ１）漂洗液WB（Ｗ2）、洗脱液EB（Eｌuent）、含pＭD1９-T质粒得大肠杆菌ＤH５α

3、质粒DNA得定量（紫外分光光度法)

仪器:比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪

材料:蒸馏水、质粒ＤＮA

4、质粒ＤNA得酶切鉴定

仪器：1、５mｌ得EP管、微量加样枪

材料：无菌水、1０×Ｍ酶切缓冲液BuｆR、质粒DNA、Hind IＩI （1５Ｕ/ul）、EcoR I(1２Ｕ/ul)

5、琼脂糖凝胶电泳

仪器:凝胶电泳系统、凝胶成像系统

材料:电泳指示剂、Ｇｅｌｖiew、TＢE、琼脂糖、DNA Ｍａｒｋer ５０00、电泳缓冲液

（二）实验方法

1、PCR

2、

3

４

5

（一）实验现象

１、加入溶液Ｐ1,出现悬浮现象；

2、加入溶液P2,温与混匀，溶液会变得清亮；

3、加入溶液P3，有白色絮状沉淀生成;

4、电泳时，可观察到在电流作用下，点样得溶液出现电泳现象，电泳速度不同。

在紫外检测仪条件下，可以观察到不同得物质出现不同得电泳带。

(二）实验结果

原始实验数据

测量次数质粒ＤNA浓度(ug/ｍl）Ｒatio比值（A260/A2８0)

1 1４81、4６

2106 1、52

3 1151、45

平均值123１、4７

电泳后得图片

（四)实验分析

1、由上数据可知，Ｒatｉo=１、47

A260/A280<１、8 表明样品中含有较多得蛋白质（芳香族)

2、在图片中，其她三类DＮＡ与Maker相比较,可知质粒ＤNＡ得分子大小在２50０b ｐ－35００ｂp，酶切反应得质粒ＤＮA片段分子大小在2800—30０0ｂp与40０-5０0左右，PCR得DＮA分子大小在４00-５０0ｂp.基本符合预期.

(四)实验讨论

1、质粒DNＡ中出现三条带，分别对应超螺旋质粒DＮA、线性DＮA与开环状质粒DNA。这三种不同构型得分子有不同得迁移率，在一般情况下，迁移速度最快得为超螺旋型,其次为线性分子,最慢得为开环状分子,所以条带从上到下分别为：超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。，