孚尔根(FEULGEN) 染色
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孚尔根（FEULGEN） 染色法
1202班二组
成员： 韩恺 陈辰 丛林 刘丹 刘丹然 姚璐璐 主讲人：韩恺
1924年孚尔根首先用 Schiff试剂作试验，鉴定了 染色体上DNA的存在，故 称为孚尔根染色法。
自从1924年Feulgen等人建立了 DNA-Feulgen染色方法以来,至今这 种方法仍是DNA定量测定的主要染 色方法之一.Feulgen染色是经典显 示脱氧核糖核酸的方法,是DNA的一 个特异性检查法该法要求用Carnay 氏液固定的新鲜组织效果最好,酒精甲醛液次之,单纯甲醛固定欠佳,效果 并不使人满意.
4. Schiff试剂的作用：Feulgen反应成功 与否的一个非常关键的因素，就是 schiff试剂的质量。有一大类试剂均称 为碱性品红，它们实际上是由几种产 品分别组成的。因此只能选用注明 “DNA染色反应用”的碱性品红才行。 此外，Schiff试剂的配制方法也可影响 DNA的染色反应。
THE END
孚尔根染色法的反应原理主要与Schiff试剂的化学性质有关，此试剂的基本 成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是 三氨基三苯甲烷氯化物。
碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时被氧化， 使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚 磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分 子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色 利用1M HCl 、60℃下水解时，可将DNA分子中 嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤 脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂 反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一 的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定 DNA的存在。
反应原理
样品经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤 碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛 基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应， 形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色 团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经 稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用， 可与无色品红结合形成紫红色化合物，从 而显示出DNA的分布。
实验现象
注意事项
1. 对照切片的制做：进行Feulgen反应时, 一 般要做一对照切片以便验证反应结果。对 照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且 应为负反应。但需要注意的是，对照切片 在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)， 时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水 解，从而出现假的正反应。
实验试剂
•1. Carnoy固定液： 3份95%酒精加入一份冰醋 酸。 • 2.1mol/L HCl：取比重1.18的浓HCl82.5ml，加 水100ml。 •3. Schiff 试剂 •4. 亚硫酸水溶液（漂白液） 10%偏重偏亚硫 酸钠水溶液5ml，蒸馏水100 ml， 1mol/L HCl 5ml，摇匀，塞紧瓶塞。此溶液在 使用前配制，否则会因SO2逸出而失效。
Schiff 试剂的配置
称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶）， 时时振荡，继续煮 5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然 后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1N HCl，冷却至 25℃时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡 后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天）， 使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟， 最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应 为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不 能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之 再转变为无色时，仍可再用
操作方法及步骤
以Feulgen染色法观察洋葱根尖有丝分裂为例
ห้องสมุดไป่ตู้
•1．将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1N HCl中， 加热到60℃水解8～10 min。 • 2．蒸馏水水洗。 •3．Schiff试剂遮光染色30min。 •4．用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次 1min。 • 5．水洗5min。 •6．将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖 玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。 • 7．显微镜检查。 结果：细胞中凡有DNA的部 位应呈现紫红色的阳性反应。
2、 固定剂的选择：实践证明，一切好的 组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如 Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming 固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂 等， 但在上述固定剂中， Carnoy效果较 好，价格廉价，制作都比较方便，因此， 本实验采用carnoy试剂。
3. 水解时间：Feulgen反应通常用稀酸进 行水解，但水解的时间一定要适当。如 水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时 间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核 糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的 水解时间一般为8~12min。但是水解时间 长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定 剂的性质以及酸的浓度而定。
1202班二组
成员： 韩恺 陈辰 丛林 刘丹 刘丹然 姚璐璐 主讲人：韩恺
1924年孚尔根首先用 Schiff试剂作试验，鉴定了 染色体上DNA的存在，故 称为孚尔根染色法。
自从1924年Feulgen等人建立了 DNA-Feulgen染色方法以来,至今这 种方法仍是DNA定量测定的主要染 色方法之一.Feulgen染色是经典显 示脱氧核糖核酸的方法,是DNA的一 个特异性检查法该法要求用Carnay 氏液固定的新鲜组织效果最好,酒精甲醛液次之,单纯甲醛固定欠佳,效果 并不使人满意.
4. Schiff试剂的作用：Feulgen反应成功 与否的一个非常关键的因素，就是 schiff试剂的质量。有一大类试剂均称 为碱性品红，它们实际上是由几种产 品分别组成的。因此只能选用注明 “DNA染色反应用”的碱性品红才行。 此外，Schiff试剂的配制方法也可影响 DNA的染色反应。
THE END
孚尔根染色法的反应原理主要与Schiff试剂的化学性质有关，此试剂的基本 成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是 三氨基三苯甲烷氯化物。
碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时被氧化， 使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚 磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分 子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色 利用1M HCl 、60℃下水解时，可将DNA分子中 嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤 脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂 反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一 的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定 DNA的存在。
反应原理
样品经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤 碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛 基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应， 形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色 团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经 稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用， 可与无色品红结合形成紫红色化合物，从 而显示出DNA的分布。
实验现象
注意事项
1. 对照切片的制做：进行Feulgen反应时, 一 般要做一对照切片以便验证反应结果。对 照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且 应为负反应。但需要注意的是，对照切片 在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)， 时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水 解，从而出现假的正反应。
实验试剂
•1. Carnoy固定液： 3份95%酒精加入一份冰醋 酸。 • 2.1mol/L HCl：取比重1.18的浓HCl82.5ml，加 水100ml。 •3. Schiff 试剂 •4. 亚硫酸水溶液（漂白液） 10%偏重偏亚硫 酸钠水溶液5ml，蒸馏水100 ml， 1mol/L HCl 5ml，摇匀，塞紧瓶塞。此溶液在 使用前配制，否则会因SO2逸出而失效。
Schiff 试剂的配置
称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶）， 时时振荡，继续煮 5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然 后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1N HCl，冷却至 25℃时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡 后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天）， 使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟， 最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应 为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不 能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之 再转变为无色时，仍可再用
操作方法及步骤
以Feulgen染色法观察洋葱根尖有丝分裂为例
ห้องสมุดไป่ตู้
•1．将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1N HCl中， 加热到60℃水解8～10 min。 • 2．蒸馏水水洗。 •3．Schiff试剂遮光染色30min。 •4．用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次 1min。 • 5．水洗5min。 •6．将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖 玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。 • 7．显微镜检查。 结果：细胞中凡有DNA的部 位应呈现紫红色的阳性反应。
2、 固定剂的选择：实践证明，一切好的 组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如 Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming 固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂 等， 但在上述固定剂中， Carnoy效果较 好，价格廉价，制作都比较方便，因此， 本实验采用carnoy试剂。
3. 水解时间：Feulgen反应通常用稀酸进 行水解，但水解的时间一定要适当。如 水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时 间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核 糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的 水解时间一般为8~12min。但是水解时间 长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定 剂的性质以及酸的浓度而定。