离子对色谱法

A
水相
+B
+ 水相
A B
+ 有机相
A- —待测离
由于离子对A-B+具有疏水性,可被非极性 固定相提取.其它待测离子A1,A2, A3……..因与B离子间的成对能力不同,而 形成不同疏水性的离子对,它们在柱内的 保留值不同,从而达到各组分离子相互分 离的目的. (2)动态离子交换 认为离子对试剂的疏水部分,吸附到固定相并 形成动态的离子交换表面,待测离子被保留在 这个动态的离子交换表面上.
阴离子分离 氢氧化铵 氢氧化四甲基铵( TMAOH) 氢氧化四乙基铵( TEAOH) 氢氧化四丙基铵( TPAOH) 氢氧化四丁基铵( TBAOH) 阳离子分离 HCI HCIO4 全氟羧酸 戊烷磺酸 己烷磺酸 庚烷磺酸 辛烷磺酸
疏水性增加 ZZZENGJIA
疏 水 性 增 加
常用的有机改性剂:乙睛,甲醇,异丙醇
(九)离子对色谱法(MPIC)
Ion pair chromatography
1. 原理:主要是基于待测组分在分析柱上的吸 附作用不同而进行分离的. 固定相:疏水性的苯乙烯/二乙烯苯树脂或键合的 硅胶. 流动相:水+离子对试剂+有机溶剂 离子对试剂:所带电荷与待测离子相反.
分析柱的选择性:主要由流动相决定.改变 离子对试剂和有机溶剂的类型及浓度,可改变分 离的选择性. 机理,有三种模式: (1)离子对形成:待测离子与"离子对试剂",形 成中 性的"离子对"化合物,利用它在流动相和 固定相之间的分配系数不同进行分离. 例如:以非极性键合相为固定相,于流动相中加 入离子对试剂B+,来分离一组阴离子:
HPLC色谱法基本要求:
1.了解HPLC色谱法的特点,与GC比较有 么优缺点? 2.掌握液相色谱仪的基本结构及基本概念 , 梯度洗脱 3.掌握HPLC常用检测器的类型,特点和应 用 4.熟悉HPLC色谱的固定相和流动相 5.掌握常用HPLC方法的分离原理,固定相 和流动相的选择及应用
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要求:
(1)不与试样或填料有任何吸附,分配等作用. (2)能润湿凝胶和溶解样品 (3)粘度低 ( 分子易扩散),分离效果好. (4)沸点通常大于柱温20～50℃ (5)与检测器匹配 常用的流动相有四氢呋喃,甲苯,N,N'-二甲基甲 酰胺,三氯甲烷,水等.
4.应用
主要用于大分子的分离,分级(相对分子质量 为2000~2000000),如蛋白质,核酸等. 思考:1,某人用凝胶色谱分离一高聚物,分 离情况很差,他改变流动相组成后,分离 情况大为改进,该说法对吗? P446 10-13
2.离子排斥色谱法的应用
主要用于弱的无机弱酸,有机酸,醇类,醛 类,氨基酸和糖类的分离分析.
(十一) 离子色谱法的应用
1,在生物化学研究中:抗生素,发酵液中阴离子及有机 酸,糖类,蛋白质,寡核苷酸, 氨基酸等的分析. 2,环境水,饮用水,生活污水,工业废水,大气中的 无机阴,阳离子,有害物质的价态形态分析. 3,痕量离子分析(半导体,电场,核电场) 4,复杂基体中离子分析(化工原料,海水,卤制品)
解:因为8000>4000 ,故样品组分为一大于 排阻极限的分子 V0 = VR1 = 25 ml Vi = VR - V0=125-25=100 ml
K SEC =
V R样品 V0 Vi
102-25 = =0 77 100
2. 固定相
材料 葡萄糖凝胶 软性凝胶 聚苯乙烯 聚苯乙烯 半刚性凝胶 聚乙酸酯 玻璃珠 刚性凝胶 多孔硅胶
七.色谱分离方法的选择
要正确地选择色谱分离方法,首先必须尽可 能多的 了解样品的有关性质,其次必须熟悉 各种色谱方法的主要特点及其应用范围. 选择色谱分离方法的主要根据: 是样品的 对分子质量的大小,在水中和有机溶剂中的溶 解度,极性和稳定程度以及化学结构等物理, 化学性质.
Байду номын сангаас
(一),相对分子质量 1,相对分子质量低,沸点低,热稳定性好的样 品,用气相色谱法分析. 2,相对分子质量在200 ~ 2000的化合物,用液 固吸附,化学键合相色谱和离子交换色谱法. 3,相对分子质量高于2000的化合物,用空间排 阻色谱法. (二),溶解度
类型
型号 Sephadax Bio-head-S Styragel Emgel(OR) CPG-10 Porasil
特点 溶胀 , 小分 子分离 溶胀较小 流速较小 刚性大,高 流速分离
流动相 水 有机溶剂 有机溶剂 有机溶剂 有机溶剂和水 有机溶剂和水
3 流动相
在凝胶色谱中,流动相的作用不是为了控制分离, 而是为了溶解样品,并载带样品流过色谱柱.
K SEC
[C s ] V R V 0 = = [C m ] Vi
尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合: 0 ≤ KSEC ≤ 1 大于排阻极限的分子,KSEC=0 , VR = V0 小于排阻极限的分子,KSEC=1.0 , V R = V0 + V i
练习:P441
一相对分子质量是80000的分子通过一排阻极 限为40000的柱子,保流体积为VR =25ml.另 一足够小能够完全进入孔内的化合物的保流体 积为125ml.样品组分的保流体积为102ml. 计算间隙体积V0,总孔容积Vi和样品组分的分 配系数.
1.原理 基于固定相和待测物之间三种不同 的作用力-Donnan排斥,空间排斥和吸附作用 分离的. 分离阴离子用强酸性高交换容量的阳离子交换 树脂,分离阳离子用强碱性高交换容量的阴离 子交换树脂.
如分离阴离子Cl- 和CH3COO- : Cl-在强酸性阳离子交换树脂上形成H+Cl-,因受 排斥作用而不能穿过半透膜进入树脂的微孔,它 迅速通过色谱柱而无保留.而CH3COO-则形成 CH3COOH,可以穿过半透膜进入树脂微孔. 电解质的离解度越小,则受排斥作用越小,在树 脂中的保留值越大.
5,金属含氧酸的测定(电镀液等) 6,有机化合物分析 7,食品,饮料中的有机酸,酸味剂,防腐剂,风 添加剂等 8,有机胺类化合物; 9,药物和农药(特别是无紫外吸收的化合物) 10,表面活性剂 11,过渡金属离子的分析
五.排阻色谱法 Steric exclusion chromatography(SEC)
六,亲合色谱简介
利用生物大分子与固定相之间的特异亲合力, 进行复杂生物样品的分离及纯化. 分离原理:于载体表面先键合具有一般反应性 能的环氧或联氨,然后再连接上配基,如酶, 抗原或激素.当含有复杂混合试样的流动相流 经这种经固定化的配基时,其中具有亲合力特 性的生物大分子与配基相互作用而被保留,无 此作用的则被洗出;随后,改变流动相pH或 组成,再将被保留的大分子组分以纯品的形式 洗脱出来. 特点:选择性过滤,纯化效果好.
排阻色谱又称空间排阻色谱或凝胶色谱法. 1. 分离原理: 是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分 离的. 固定相:是一种表面惰性,具有一定孔径小孔 的多孔凝胶.孔径:数nm~数百nm
对流动相分子:可自由出入孔穴 对溶质分子: 大分子 —— 不能渗入孔穴中而被排阻,最先流出 色谱柱. 中等分子 —— 部分渗透,以中等速度流出色谱柱 小分子 —— 完全渗透,最后流出色谱柱. 即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中 流出.
(3)离子相互作用:
2.离子对试剂的选择
(1)分离亲水性离子——选用疏水性离子对 试剂. 分离疏水性离子——选用亲水性离子对试剂. (2)相对分子量较小的离子对试剂比分子量大 的分离效果更好. 离子对试剂的浓度:一般5×10—4～10-1mol.L-1 浓度越大,被分离物的保留值也越大.
表3常用的离子对试剂
凝胶固定相的排阻极限A点:>A点相对分子质量 的分子,均被派拆所有凝胶孔内,以单一谱带析 出,保留体积V0
相 对 分 子 质 量
A B
洗脱体积V
全渗透极限B点:<B点相对分子质量的分子, 能完全进入凝胶孔内,以单一谱带析出, 保留体积Vt AB段:选择性渗透. 由色谱过程基本方程知:VR = V0 +KSEC Vi Vi——凝胶内孔体积(总孔容积) KSEC——分配系数
1,水溶性样品,用离子色谱和化学键合相色谱 法; 2,微溶于水,但在酸或碱存在下能电离的化合物,用离 子色谱法; 3,油溶性或相对非极性的样品,用液-固吸附色谱法.
(三),化学结构
1,离子型或可离子化的化合物,或者能与 离子型化合物相互作用的物质,用离子色 谱,也可用空间排阻色谱; 2,异构体用液固吸附色谱法; 3,具有不同官能团的化合物,同系物,用 反相化学键合相色谱法; 4,高分子聚合物,用空间排阻色谱法.
分子量 水溶性 >2000
方法
流动相 水
可溶或不溶 排阻色谱
<2000 可溶但不离 酚,醚,胺等:化学键合相色谱 各种 解 分子量较大的:排阻色谱 水 可溶且离解 酸或阴离子:阴离子交换色谱 缓冲液 碱或阳离子:阳离子交换色谱 不溶 多官能团化合物,异构体,稳定 各种 化合物:液固吸附色谱.如脂溶 性维生素,酚,醇 不稳定化合物,同系物:化学键 各种 合相色谱. 相对分子量较大且尺寸不同的化 各种 合物:排阻色谱(如增塑剂)
思考:在 pH值=7时,分离一组羧酸,若用离
子对色谱法分离,应如何选择离子对试剂? 3.离子对色谱法的应用 可用于分离大分子量的阴,阳离子,特别 是带局部电荷的大分子及疏水性阴,阳离 子.包括阴,阳离子表面活剂,大分子脂 肪羧酸,烷基磺酸盐和芳香硫酸盐,季铵 化合物,水溶性维生素,酚类等.
(十)离子排斥色谱法