离子对色谱法
离子对色谱法的原理
离子对色谱法的原理
离子对色谱法是一种基于溶液中的阳离子和阴离子之间形成稳定络合物的原理进行分离及分析的方法。
其原理主要包括样品溶液中的离子和离子对试剂之间的化学反应和络合物的稳定性。
在离子对色谱法中，通常使用正离子对试剂与样品中的阴离子形成稳定的络合物。
正离子对试剂可以是有机胺、季铵盐或金属络合物等化合物。
当正离子对试剂与样品中的阴离子结合形成络合物后，这些带电的络合物会在色谱柱中进行分离。
分离过程中，离子对络合物的迁移速度受到许多因素的影响，包括络合物的结构、柱填料的性质以及运行条件等。
离子对色谱法最常用的方法是反相离子对色谱法。
在反相离子对色谱法中，色谱柱填料通常具有亲水性，即带有极性的官能团。
这种填料可以吸附和保持离子对络合物，从而实现它们的分离。
分离过程通常通过使用含有盐溶液的流动相来进行，盐的存在可以影响吸附和解吸过程，改变离子对络合物的保持时间和分离效果。
离子对色谱法具有广泛的应用领域，包括环境监测、药物分析、生物分析以及食品分析等。
该方法可以用于分离并测定许多阴离子，如无机阴离子、有机酸、氨基酸和药物等。
离子对色谱法具有高分辨率、准确性和灵敏度，适用于复杂混合物的分析，是一种常用的分离和定量分析方法。
离子对色谱法测定组氨酸的含量
离子对色谱法测定组氨酸的含量摘要目的：建立采用高效液相色谱法测定组氨酸含量的方法。
方法：选用Copsil C18色谱柱，流动相：乙腈-阴离子型离子对试剂；流速：1.0 ml/min，进样体积：20μl，柱温：30℃，检测波长：205nm。
结果：线性相关系数为0.99986，定量限0.8ng，检测限0.08ng，回收率在98 %～102 %之间。
结论：方法简便快速，结果准确可靠，可用于组氨酸的含量测定。
关键词：组氨酸，离子对色谱法，含量测定组氨酸是组成蛋白质的基本单元，具有极其重要的生理功能。
被认为是一种人类必需的氨基酸，主要是对于儿童。
其含量测定方法有电位滴定法、茚三酮比色法、高效液相色谱法、氨基酸分析仪等。
目前，高效液相色谱法使用最为广泛，但由于大多数氨基酸本身没有紫外吸收和荧光反应，需要对样品进行衍生处理将其转化为有紫外吸收和荧光的物质，所以此方法操作复杂，用时长。
因此在需要建立一种简便可行的检测方法。
组氨酸含有咪唑基，在紫外光末端有吸收，且属弱碱性氨基酸，可采用离子对高效液相色谱法直接测定其含量。
本方法使用十八烷基硅烷键合硅胶填充柱为分析柱，乙腈-阴离子型离子对试剂为流动相的离子对色谱法测定组氨酸的含量。
1 实验部分1 主要仪器和试剂1.1 仪器高效液相色谱仪（Agilent 1200）、色谱柱、电子分析天平、酸度计1.2 试剂组氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸均为(工作标准品,Sigma-Aldrich),腺嘌呤、胞嘧啶、胞苷均为(试剂,Sigma-Aldrich)，乙腈、磷酸为色谱纯，辛烷磺酸钠（离子对试剂，麦克林)、三乙胺（分析纯，广州化学试剂厂)，水为超纯水2 实验步聚2.1 含量测定色谱条件和系统适用性试验色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(Sagix：Copsil C18，规格5 µm×4.6 mm×250mm)，流动相：称取辛烷磺酸钠2.16g，硫酸铵4.4g，加水900ml溶解，加入三乙胺2ml，用磷酸调pH至3.0，经0.22μm水系滤膜过滤，取滤液与乙腈以90∶10（V/V）混匀。
反相离子对色谱法
反相离子对色谱法
反相离子对色谱法（Reversed-Phase Ion Pair Chromatography, RP-IPC）是一种液相色谱法，常用于对带正电或负电的离子类化合物进行分离和定量分析。
该方法的原理是在一定的流动相条件下，使用一种含正离子对剂的有机溶剂作为移动相，使得样品中的离子类化合物与正离子对剂形成离子对的结合，在反相色谱柱上进行分离。
正离子对剂通常是醇胺类、季铵盐类或草酸钠等。
其中带正电的离子类化合物与正离子对剂形成胶束结构，经过反相液相色谱柱后分离，负电的离子类化合物与正离子对剂发生离子对结合，再经柱分离。
与传统的反相色谱相比，反相离子对色谱法的优势在于可以分离和定量测定带电离子类化合物，如药物类、生物活性物质、蛋白质和核酸等。
同时，由于离子对剂的存在，可以提高某些带电离子类化合物的保留率和分离度，增强色谱法的选择性和灵敏度。
反相离子对色谱法在药物分析、环境分析、食品安全等领域有广泛的应用。
它可以用于测定药物中杂质的含量、药物代谢产物的分离和定量、食品中添加剂的检测等。
同时，该方法还可以与其他色谱技术（如气相色谱、离子色谱等）或质谱联用，进一步提高分析的选择性和灵敏度。
离子对色谱法
离子对色谱法20世纪60年代初，Schill等人对两个相反电荷的离子相互作用形成一个中性化合物的现象进行了 系统研究，并把它引入到液相色谱中，这是最早的离子对色谱法。
20 世纪 70 年代初，发展起来了现代 离子对色谱法，早期的反相离子对色谱主要用于液—液分配色谱（固定液涂渍与载体上）。
20世纪70年 代中后期随着化学键和固定相的发展，离子对色谱不再使用涂渍型填料，而使用现在最常用的反相离子 对色谱。
离子对色谱主要分为两类：正相离子对色谱和反相离子对色谱。
因为正相离子对色谱法现在已 经很少使用，故只介绍反相离子对色谱法。
一、离子对色谱法的基本概念离子对色谱法（ion—pair chromatography，IPC）是用正相或反相色谱柱分离离子型化合物和可解 化合物的方法（counterion）与离子化的样品组分形成离子对，这种离子对同中性或非极性分子一样，可 采用分配色谱的方法进行分离。
二、反相离子对色谱法反相离子对色谱法是把离子对试剂添加到极性流动相中，被分析的样品离子在流动相中与离子对 试剂（反离子）生成不带电的中性离子对，从而增加了样品离子在非极性固定相中的溶解度，是分离系 数增加，改善分离效果。
（一） 反相离子对色谱的原理在阐述离子对色谱的保留机制时，有多种模型理论，主要理论有离子对模型和动态离子交换模型， 本书介绍离子对模型。
离子对模型认为，在反相离子对色谱中，固定相为疏水性的键合相（如ODS），被分离的离子和反 离子同时存在于强机型的流动相中两者生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配，可采用分配 色谱的方法进行分离。
对于碱性化合物（B），一般用各种烷基磺酸盐（R—SO3 Na）作离子对试剂，流动相和固定相之 间的反应如图11—1所示。
流动相 固定相B+H +«BH +RSO3Na«RSO3 +Na +BH + +RSO3 «BH + .RSO3 «[BH + .RSO3 ]图11—1 碱性化合物形成离子对示意图对于酸性化合物（RCOOH），一般用各种季铵盐，如四丁基铵类（TBA + X ）,作离子对试剂，流动 相和固定相之间的反应如图112所示。
离子对色谱法
高效液相色谱法中离子对色谱法、离子交换色谱法及离子色谱法原理的研究及应用1308102-06余胜摘要：本文主要讨论正相离子对色谱法、反相离子对色谱法、离子交换色谱发及离子色谱法的原理，以及在应用上的特征与区别。
关键词：正相离子对色谱法；反相离子对色谱法；离子交换色谱法；离子色谱法高效液相色谱法是20世纪70年代发展起来的一项高效、快速的分离技术。
液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。
在经典的液体柱色谱法的基础上引入气相色谱法的理论，在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。
他可分为离子对色谱法、离子交换色谱法及离子色谱法等，其应用非常广泛。
且具有高压、高速、高效以及高灵敏度等这几个突出的特点。
1.离子对色谱法离子对色谱法是将一种(或多种)与溶质分子电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。
用于阴离子的对离子是烷基铵类，如氢氧化四丁基胺等；用于阳离子的对离子是烷基磺酸类，如己烷磺酸钠等。
近年来有，贺霞,史朝晖等[1]通过用反相离子对色谱法测定了复方维生素片中的维生素B1、维生素B2、维生素B 6这3种水溶性维生素含量，他们以己烷磺酸钠作为离子对试剂，采用DiamonsilC18(250mm×4.6mm,5µm)柱，同时测定这三种维生素，具有好的相关性，此种方法可用于这三种物质含量的测定及质量控制研究。
随后有李小兵，王勇军等[2]用离子对色谱法检测阿德福韦酯中降解产物的含量。
采用Welch Materials XB-C8 柱(250 mm ×4.6 mm,5µ m) ，以0.05 mol ·L-1的磷酸氢二钾和0．01 mol ·L-1四丁基硫酸氢铵缓冲溶液(磷酸调pH至3.0)乙-腈(65:35)为流动相。
11-1-其他类型HPLC色谱法-离子对
第十一章其他类型高效液相色谱法
离子对色谱法
（ion-pair chromatography，IPC）
一、概述
分析对象：
有机酸、碱、两性化合物、盐、强极性化合物
二、分离原理
定义：在色谱体系中加入合适的与样品离子电荷（A+）相反的离子（B-，称为反离子，counterion)，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（呈中性），进而进行分离的一种色谱分离分析技术。
离子对形成与两相间分配示意图
碱性化合物
酸性化合物
吴春勇
Inertsil C18色谱柱（5μm，4.6
mm×150 mm）；
甲醇－5 mmol/L磷酸二氢钾溶
10 mmol/L
液（含有十二烷基磺
酸钠，用磷酸调节pH至
3.5±0.05），（64∶36）为
流动相；
流速：1.0 ml/min；
10ml/min
紫外检测波长：330 nm；
柱温：室温
吴春勇
三聚氰胺极性强，其溶解性决定其不可能使用正相色谱柱进行分离，选
较好
V 乙腈∶V 缓冲液为8∶92的分离度和峰形为较好。
2）流动相pH的确定
考察范围：pH 2.5～4
16.672 min。
16.672min。
离子对色谱法
2. 组分溶于水，可用： 组分溶于水，可用： 1）非离子型化合物用反相色谱 SP: -C18, C8等 MP：水或缓冲溶液，甲醇，乙腈， THF的混合液 2) 可离子化化合物用反相离子对色谱 SP：-C18, C8等 MP：水或缓冲溶液（含离子对试剂），甲醇，乙 腈， THF的混合液 3）离子型化合物可用离子交换色谱 或采用反相离子对色谱 SP: -SO3H, -NR3Cl型离子交换剂 MP：缓冲液
1．离子对模型 ．
以有机碱（B）为例。调节流动相pH，使碱 转变为正离子BH+形式，则BH+与流动相中 离子对试剂（烷基磺酸盐）的反离子RSO3生成不荷电的中性离子对，此中性离子对在 固定相和流动相间达到分配平衡。 B + H+ BH+ RSO3Na RSO3- + Na+ BH+ + RSO3- (BH+ RSO3-)m (BH+ RSO3-)s
九．HPLC分析方法 分析方法
（一）定性分析方法 定性分析方法 1．色谱鉴定法：只能对范围已知的化合物定性。 定性原理：同一物质在相同色谱条件下保留时间 （或保留体积或相对保留值）相同。 2．化学鉴定法 收集色谱馏分，在利用化学反应进行鉴定。 3. 两谱联用鉴定法： 离线： 制备HPLC获得纯组分，用UV, IR, MS NMR鉴定； 在线：联用仪
(二）分子量大于1000的组分 二 分子量大于 的组分 采用凝胶色谱法 1. 组分溶于水： 凝胶过滤色谱 SP：水溶性凝胶 MP：水溶液 2. 组分溶于有机溶剂 凝胶渗透色谱 SP：有机凝胶 MP：有机溶剂
Ai f i ms = mi = As f s
Ai f i ms As
fs =1
该法实际为内标一点法
反向离子对色谱法原理
反向离子对色谱法原理反向离子对色谱法（Reverse Ion Pair Chromatography，RIPC）是一种分离和分析有机物的技术，它可以用来分离和分析复杂的有机物组合物。
它是一种高效的分离技术，可以用来分离和分析复杂的有机物组合物，如蛋白质、多肽、脂质、糖类、酶、抗生素等。
反向离子对色谱法的原理是，利用离子对的相互作用，将有机物分离出来。
离子对是一种由两种不同的离子组成的离子组合物，它们之间存在着相互作用。
在反向离子对色谱法中，离子对被用来将有机物分离出来。
离子对的作用是，当有机物与离子对接触时，它们之间会发生相互作用，从而使有机物分离出来。
反向离子对色谱法的实验步骤如下：首先，将样品溶解在溶剂中，然后将溶解的样品加入到离子对溶液中，并将其加热至一定温度。
接着，将溶液中的有机物分离出来，并将其通过色谱柱进行分离。
最后，将分离出来的有机物通过检测仪进行检测，以确定其组成。
反向离子对色谱法的优点是，它可以用来分离和分析复杂的有机物组合物，而且它的分离效率非常高，可以在短时间内完成分离。
此外，它还可以用来分离和分析复杂的有机物组合物，如蛋白质、多肽、脂质、糖类、酶、抗生素等。
反向离子对色谱法的缺点是，它需要较高的技术水平，而且它的成本也比较高。
此外，它也需要较长的时间来完成分离，而且它的分离效率也不是很高。
总之，反向离子对色谱法是一种高效的分离技术，可以用来分离和分析复杂的有机物组合物，如蛋白质、多肽、脂质、糖类、酶、抗生素等。
它具有高效率、低成本和快速分离的优点，但也存在一些缺点，如需要较高的技术水平和较长的时间来完成分离。
因此，在使用反向离子对色谱法时，应该根据实际情况选择合适的方法，以获得最佳的分离效果。
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A
水相
+B
+ 水相
A B
+ 有机相
A- —待测离
由于离子对A-B+具有疏水性,可被非极性 固定相提取.其它待测离子A1,A2, A3……..因与B离子间的成对能力不同,而 形成不同疏水性的离子对,它们在柱内的 保留值不同,从而达到各组分离子相互分 离的目的. (2)动态离子交换 认为离子对试剂的疏水部分,吸附到固定相并 形成动态的离子交换表面,待测离子被保留在 这个动态的离子交换表面上.
分子量 水溶性 >2000
方法
流动相 水
可溶或不溶 排阻色谱
<2000 可溶但不离 酚,醚,胺等:化学键合相色谱 各种 解 分子量较大的:排阻色谱 水 可溶且离解 酸或阴离子:阴离子交换色谱 缓冲液 碱或阳离子:阳离子交换色谱 不溶 多官能团化合物,异构体,稳定 各种 化合物:液固吸附色谱.如脂溶 性维生素,酚,醇 不稳定化合物,同系物:化学键 各种 合相色谱. 相对分子量较大且尺寸不同的化 各种 合物:排阻色谱(如增塑剂)
5,金属含氧酸的测定(电镀液等) 6,有机化合物分析 7,食品,饮料中的有机酸,酸味剂,防腐剂,风 添加剂等 8,有机胺类化合物; 9,药物和农药(特别是无紫外吸收的化合物) 10,表面活性剂 11,过渡金属离子的分析
五.排阻色谱法 Steric exclusion chromatography(SEC)
K SEC
[C s ] V R V 0 = = [C m ] Vi
尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合: 0 ≤ KSEC ≤ 1 大于排阻极限的分子,KSEC=0 , VR = V0 小于排阻极限的分子,KSEC=1.0 , V R = V0 + V i
练习:P441
一相对分子质量是80000的分子通过一排阻极 限为40000的柱子,保流体积为VR =25ml.另 一足够小能够完全进入孔内的化合物的保流体 积为125ml.样品组分的保流体积为102ml. 计算间隙体积V0,总孔容积Vi和样品组分的分 配系数.
要求:
(1)不与试样或填料有任何吸附,分配等作用. (2)能润湿凝胶和溶解样品 (3)粘度低 ( 分子易扩散),分离效果好. (4)沸点通常大于柱温20～50℃ (5)与检测器匹配 常用的流动相有四氢呋喃,甲苯,N,N'-二甲基甲 酰胺,三氯甲烷,水等.
4.应用
主要用于大分子的分离,分级(相对分子质量 为2000~2000000),如蛋白质,核酸等. 思考:1,某人用凝胶色谱分离一高聚物,分 离情况很差,他改变流动相组成后,分离 情况大为改进,该说法对吗? P446 10-13
1.原理 基于固定相和待测物之间三种不同 的作用力-Donnan排斥,空间排斥和吸附作用 分离的. 分离阴离子用强酸性高交换容量的阳离子交换 树脂,分离阳离子用强碱性高交换容量的阴离 子交换树脂.
如分离阴离子Cl- 和CH3COO- : Cl-在强酸性阳离子交换树脂上形成H+Cl-,因受 排斥作用而不能穿过半透膜进入树脂的微孔,它 迅速通过色谱柱而无保留.而CH3COO-则形成 CH3COOH,可以穿过半透膜进入树脂微孔. 电解质的离解度越小,则受排斥作用越小,在树 脂中的点,与GC比较有 么优缺点? 2.掌握液相色谱仪的基本结构及基本概念 , 梯度洗脱 3.掌握HPLC常用检测器的类型,特点和应 用 4.熟悉HPLC色谱的固定相和流动相 5.掌握常用HPLC方法的分离原理,固定相 和流动相的选择及应用
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七.色谱分离方法的选择
要正确地选择色谱分离方法,首先必须尽可 能多的 了解样品的有关性质,其次必须熟悉 各种色谱方法的主要特点及其应用范围. 选择色谱分离方法的主要根据: 是样品的 对分子质量的大小,在水中和有机溶剂中的溶 解度,极性和稳定程度以及化学结构等物理, 化学性质.
(一),相对分子质量 1,相对分子质量低,沸点低,热稳定性好的样 品,用气相色谱法分析. 2,相对分子质量在200 ~ 2000的化合物,用液 固吸附,化学键合相色谱和离子交换色谱法. 3,相对分子质量高于2000的化合物,用空间排 阻色谱法. (二),溶解度
1,水溶性样品,用离子色谱和化学键合相色谱 法; 2,微溶于水,但在酸或碱存在下能电离的化合物,用离 子色谱法; 3,油溶性或相对非极性的样品,用液-固吸附色谱法.
(三),化学结构
1,离子型或可离子化的化合物,或者能与 离子型化合物相互作用的物质,用离子色 谱,也可用空间排阻色谱; 2,异构体用液固吸附色谱法; 3,具有不同官能团的化合物,同系物,用 反相化学键合相色谱法; 4,高分子聚合物,用空间排阻色谱法.
凝胶固定相的排阻极限A点:>A点相对分子质量 的分子,均被派拆所有凝胶孔内,以单一谱带析 出,保留体积V0
相 对 分 子 质 量
A B
洗脱体积V
全渗透极限B点:<B点相对分子质量的分子, 能完全进入凝胶孔内,以单一谱带析出, 保留体积Vt AB段:选择性渗透. 由色谱过程基本方程知:VR = V0 +KSEC Vi Vi——凝胶内孔体积(总孔容积) KSEC——分配系数
阴离子分离 氢氧化铵 氢氧化四甲基铵( TMAOH) 氢氧化四乙基铵( TEAOH) 氢氧化四丙基铵( TPAOH) 氢氧化四丁基铵( TBAOH) 阳离子分离 HCI HCIO4 全氟羧酸 戊烷磺酸 己烷磺酸 庚烷磺酸 辛烷磺酸
疏水性增加 ZZZENGJIA
疏 水 性 增 加
常用的有机改性剂:乙睛,甲醇,异丙醇
六,亲合色谱简介
利用生物大分子与固定相之间的特异亲合力, 进行复杂生物样品的分离及纯化. 分离原理:于载体表面先键合具有一般反应性 能的环氧或联氨,然后再连接上配基,如酶, 抗原或激素.当含有复杂混合试样的流动相流 经这种经固定化的配基时,其中具有亲合力特 性的生物大分子与配基相互作用而被保留,无 此作用的则被洗出;随后,改变流动相pH或 组成,再将被保留的大分子组分以纯品的形式 洗脱出来. 特点:选择性过滤,纯化效果好.
(九)离子对色谱法(MPIC)
Ion pair chromatography
1. 原理:主要是基于待测组分在分析柱上的吸 附作用不同而进行分离的. 固定相:疏水性的苯乙烯/二乙烯苯树脂或键合的 硅胶. 流动相:水+离子对试剂+有机溶剂 离子对试剂:所带电荷与待测离子相反.
分析柱的选择性:主要由流动相决定.改变 离子对试剂和有机溶剂的类型及浓度,可改变分 离的选择性. 机理,有三种模式: (1)离子对形成:待测离子与"离子对试剂",形 成中 性的"离子对"化合物,利用它在流动相和 固定相之间的分配系数不同进行分离. 例如:以非极性键合相为固定相,于流动相中加 入离子对试剂B+,来分离一组阴离子:
思考:在 pH值=7时,分离一组羧酸,若用离
子对色谱法分离,应如何选择离子对试剂? 3.离子对色谱法的应用 可用于分离大分子量的阴,阳离子,特别 是带局部电荷的大分子及疏水性阴,阳离 子.包括阴,阳离子表面活剂,大分子脂 肪羧酸,烷基磺酸盐和芳香硫酸盐,季铵 化合物,水溶性维生素,酚类等.
(十)离子排斥色谱法
类型
型号 Sephadax Bio-head-S Styragel Emgel(OR) CPG-10 Porasil
特点 溶胀 , 小分 子分离 溶胀较小 流速较小 刚性大,高 流速分离
流动相 水 有机溶剂 有机溶剂 有机溶剂 有机溶剂和水 有机溶剂和水
3 流动相
在凝胶色谱中,流动相的作用不是为了控制分离, 而是为了溶解样品,并载带样品流过色谱柱.
(3)离子相互作用:
2.离子对试剂的选择
(1)分离亲水性离子——选用疏水性离子对 试剂. 分离疏水性离子——选用亲水性离子对试剂. (2)相对分子量较小的离子对试剂比分子量大 的分离效果更好. 离子对试剂的浓度:一般5×10—4～10-1mol.L-1 浓度越大,被分离物的保留值也越大.
表3常用的离子对试剂
排阻色谱又称空间排阻色谱或凝胶色谱法. 1. 分离原理: 是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分 离的. 固定相:是一种表面惰性,具有一定孔径小孔 的多孔凝胶.孔径:数nm~数百nm
对流动相分子:可自由出入孔穴 对溶质分子: 大分子 —— 不能渗入孔穴中而被排阻,最先流出 色谱柱. 中等分子 —— 部分渗透,以中等速度流出色谱柱 小分子 —— 完全渗透,最后流出色谱柱. 即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中 流出.
解:因为8000>4000 ,故样品组分为一大于 排阻极限的分子 V0 = VR1 = 25 ml Vi = VR - V0=125-25=100 ml
K SEC =
V R样品 V0 Vi
102-25 = =0 77 100
2. 固定相
材料 葡萄糖凝胶 软性凝胶 聚苯乙烯 聚苯乙烯 半刚性凝胶 聚乙酸酯 玻璃珠 刚性凝胶 多孔硅胶
2.离子排斥色谱法的应用
主要用于弱的无机弱酸,有机酸,醇类,醛 类,氨基酸和糖类的分离分析.
(十一) 离子色谱法的应用
1,在生物化学研究中:抗生素,发酵液中阴离子及有机 酸,糖类,蛋白质,寡核苷酸, 氨基酸等的分析. 2,环境水,饮用水,生活污水,工业废水,大气中的 无机阴,阳离子,有害物质的价态形态分析. 3,痕量离子分析(半导体,电场,核电场) 4,复杂基体中离子分析(化工原料,海水,卤制品)