石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
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石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
1、组织的采集、固定和保存：
采取组织后，
方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜
方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：
固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10m，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：
保存于4C 70%乙醇中的组织样品
80%乙醇 15 min
95%乙醇 15 min
100%乙醇 15min 2
1/2乙醇1/2二甲苯 15 min
二甲苯透明 5-10 min
1/2二甲苯1/2石蜡 30 min
石蜡（1）
石蜡（2）
石蜡（3）包埋
RT保存
3、石蜡组织切片的免疫组化方法：
密封保存于RT的组织切片
二甲苯(1) 20 min
二甲苯(2) 20 min
100%乙醇 20min
95%乙醇 10 min
80%乙醇 10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
切片在PBS中浸泡 5 min*2
%Tritonx RT 10 min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
3%H2O2 RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
%胰酶RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+%Tritonx-100 in PBS) RT 60min
倾去blocking buffer，勿洗
一抗4C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h
切片在PBS中浸泡 5 min*3
DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）
如果是增强型DAB只要1min即可。
切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s，
玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。
若颜色太深，可用盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久）
脱水85%乙醇 5 min
95%乙醇 5 min
无水乙醇 5 min
无水乙醇 5min
二甲苯(1) 10min
二甲苯(2) 10min
中性树胶封片，室温干燥保存
4、石蜡组织切片的免疫荧光方法：
密封保存于RT的组织切片
二甲苯(1) 20 min
二甲苯(2) 20 min
100%乙醇 20min
95%乙醇 10 min
80%乙醇 10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
切片在PBS中浸泡 5 min*2
%Tritonx RT 10 min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
切片在PBS中浸泡 5 min*3
%胰酶RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+%Tritonx-100 in PBS) RT 60min
倾去blocking buffer，勿洗
一抗4C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1：1000，GAM-488 1：1000RT 1h
DAPI（1：1000请根据二抗说明稀释二抗）
切片在PBS中浸泡 5 min*3
moil封片，避光4C保存