海洋分枝杆菌单细菌悬液制备(用于胚胎微注射)

海分枝杆菌单细菌制备（待审核）

1.材料

5μm滤器，0.2μm滤器，10mL注射器，50ml离心管，15ml离心管，100ml锥形瓶，90mm培养皿，32℃培养箱，32℃恒温摇床，分光光度计，超声破碎仪，冻存管，生物安全柜，封口膜，玻璃珠、ddH2O，7H10 –OADC培养基，7H9-OADC培养基，潮霉素（50mg/ml），7H9+10%（或15%）甘油（不含OADC，0.22μm滤器滤过）。

2.具体操作步骤

1)海分枝杆菌100μl滴于7H10 –OADC固态培养基上，并用玻璃珠划匀。使

用封口膜密封培养于32℃培养箱中，待单克隆细菌长起。【8天左右】

2)用带枪头的移液枪挑取长好的单克隆细菌接种于3ml 7H9-OADC培养基+3μl

潮霉素中（在50ml离心管），32ºC、125rpm恒温摇床旋转培养至早期对数生长期（OD600nm=0.6-1.0）【大概4-6天】（建议4天时测OD值）

3)以1:100接种于30ml 7H9液体培养基的100ml锥形瓶中（注：30ml

7h9+oadc，另加30μl潮霉素）进行扩大培养至OD=0.6-1 【大概4-6天】（建议4天时测OD值，最好OD≈1）

4)将30ml菌液分三管倒入50ml离心管（每管10ml），常温rpm

4000[RCF=3000，换算公式为RCF=1.12r（rpm/1000）2,半径单位mm] 离心3分钟，弃上清（剩约300ul液体，振荡悬起沉淀）.

5)每管加入1mL 7H9+10%甘油用于冻存，用1ml移液枪从离心管吸出菌液放入

1.5mlEP管，共 3 EP管，然后去超声波破碎成单细菌（超声设置：功率

100%，超声开时间15s，超声关时间10s，处理2分钟）

6)超声完毕后，用5ml或10mL注射器（带针头）吸取悬液，去针头后使用5

μm孔径的滤器进行过滤（三管都要过滤，过滤前可先用无菌纯水润洗滤膜），滤液收集到新的15mL离心管内。（注意：过滤时可能出现过滤液是澄清的状态，此时再次用注射器吸取7H9+10%冻存液1-2ml后，去针头冲洗过滤膜，大概率将细菌冲洗下来。可每过滤一管冲洗一次。此尤为重要。

实在冲不下来，只能收集多管过滤菌液合一管后，3000g离心1min后去上清后涡旋震荡，经过实践单细菌可用于胚胎微注射）

7）吸取过滤液1ml到比色皿中，用分光光度计测量OD值，大概率OD>1，之后利用公式稀释成所需要的OD值（目前所用的是0.7）。取1.5mlEP管（无菌）若干，每管分装10μl菌液，每分装6管，则涡旋震荡数秒再继续分装。

计算示例：如已测菌液OD为1.1，且有4ml，而所需菌液OD为0.7，那么另需要7H9+10%甘油多少？1.1×4=0.7X，X=6.3，则另外加6.3-4=2.3ml

7)分装完放入-80度冰箱，冻存3天后，方法①：取一支向其中加入1mL

7H9。混匀后，取100μL菌液分别稀释1000倍、1万倍、10万倍后用于铺CFU进行计数。(OD值为1时，1ml菌液CFU铺板结果约为2.6*10^8个。

故上述稀释1000倍、1万倍、10万倍的CFU结果应分别为2600、260、26左右)。方法②：取一只冻存管，加入3μl酚红，超声1分钟，参数同上，涡旋震荡数秒，将菌液加入注射针中，用微注射仪将常用注射体积打入100μl RNase free water，放入7h10+oadc+潮霉素固体培养基中，cfu计数。