高级生化部分知识点

构建克隆时阳性克隆的筛选方法和基本原理

阳性克隆:指的是外源目的基因与载体能够成功连接，并且目的基因能在载体中稳定复制、保存的重组子。

阳性克隆的筛选与鉴定可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行。鉴定阳性克隆有许多方法，如抗性筛选、α互补筛选（蓝白斑）、插入失活表达筛选、噬菌斑筛选、杂交法筛选、免疫学筛选、酶切图谱鉴定、PCR鉴定等。常用蓝白筛选，即抗性平板上出现白色菌落，说明连接的重组质粒被转化。（原理：X-gal是5- 溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG 是异丙基硫代半乳糖苷为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ 的表达。在含有X-gal和IPTG 的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。）根据蓝白的比例可以判断重组率，根据菌落数目可以计算出转化率。挑选白色集落后摇菌，再做miniprep后酶切确定。也可以任意挑取10－20个克隆做miniprep后酶切确定。（基本原理详细见书上）

实验室常用的蛋白质表达系统及其应用价值

酵母双杂交技术：是在真核模式生物酵母活细胞体内分析、研究蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统。对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测到，这是一种具有很高灵敏度地研究蛋白质之间关系的技术。原理：基于具有两个或两个以上相互独立的结构域构成的真核生物转录调控因子组件式结构建立了该系统。其中DNA结合结构域(DB)可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游。转录激活结构域(AD)可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。DB和AD它们是转录激活因子发挥功能所必需的。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵（bait）”和“猎物或靶蛋白（prey or target protein）”。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因（reporter gene）。通过对报道基因表达产物的检测，反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。应用：大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此它在许多的研究领域中有着广泛的应用。利用酵母双杂交：1、发现新的蛋白质和蛋白质的新功能2、在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用3筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响以达到治疗疾病的目的4建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map)：对于认识一些重要的生命活动如信号传导、代谢途径等有重要意义。

分子生物学技术在微生物学科领域的应用

分子生物学技术主要包括：体外重组DNA技术，微生物突变及诱变技术，核酸技术及遗传育种

1.分子生物学技术应用于环境保护方面。如以DNA序列和相关的结构基因为基础的分子生物学技术（①PCR及衍生技术RT-PCR、PCR-DGGE、PCR-SSCP和巢式-PCR等；②限制性片段长度多态性(RFLP)分析③寡核苷酸荧光原位杂交技术(FISH)④DNA生物传感器⑤DNA重组技术等）在污水处理中用来检测系统微生物和分析群落数量, 群体结构和活性, 从而实现构建人工强化生态系统, 提高废水生物处理效率的目的。

2.生物学技术应用于微生物的分类鉴定中。微生物的分类一直以形态学特征为主，随着新的分类手段分子生物学技术(酸杂交，16SrRNA 序列分析, RFLP及RAPD技术,氨基酸序列分析法,蛋白质图谱分析与核型分析)不断引入，给微生物分类鉴定从一般表型特征鉴定深化为遗传型特性的鉴定带来了突破性进展。

3.分子生物学技术在微生物采油中的应用。随着分子生物学技术的应用,突破了油藏微生物资源纯培养技术的瓶颈,从分子水平上较为客观地揭示了油藏微生物的多样性,深刻影响着微生物采油机理研究和应用研究的发展方向。目前用于微生物采油的分子生物学技术主要有16S rRNA基因克隆文库、基因芯片(Microchip)、变性(温度)梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)、末端限制性片段长度多态性分析(T2RFL P)、反相基因组探针(RS-GP)、荧光原位杂交(FISH)和基因工程等技术。

4.分子生物学技术在食品微生物检测中的应用。利用多重PCR技术，核酸探针技术，基因芯片技术，DNA指纹图谱等技术应用食品安全检测中食品微生物群落分析，分型鉴定。

5.分子生物学技术应用于临床医学中微生物的检验。一个感染诊断的确立需依靠临床徽生物学检验。核酸探针和核酸体外扩增技术（PCR）的发展为病原体的分类和快速鉴定提供了一种有效手段，而用在流行病调查中质粒和染色体指纹图分析法可准确地确定传染源。

6.另外，分子生物学的许多技术还被广泛应用于育种，环境工程微生物检测，工程菌的挑取、培养及在污泥、生物膜、底泥和土壤等微生物种群的多样性分析方面等。

研究新基因序列的可能分布与生理功能推测

酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。

利用NCBI的 B1ast程序对新基因及编码蛋白质进行同源性分析;以BLAST Human Sequences程序进行电子染色体定位;以BioEdit7.0.1软件分析新基因的酶切位点;运用PSORTll软件预测蛋白质细胞内定位;运用ExPASy网站的多个软件对新基因编码蛋白质的理化性质、跨膜区和信号肽序列、疏水性，功能位点进行分析和预测。了解其功能，利用多组织RT-PCR、Northern印迹杂交和原位杂交实验，对新基因的组织表达谱和功能进行了初步研究，并构建了新基因的真核表达载体。

根据蛋白质表达谱的差异，发现新的蛋白：1.提取、纯化该蛋白（测定该蛋白的序列，合成相同序列的多肽）2.用该蛋白或合成的多肽免疫动物，制备相应的抗体。3.构建相对应的表达型cDNA文库。4.用该抗体作原位杂交，钓取表达该蛋白的克隆。5.测定该克隆的DNA 序列。6.比较Gene Bank已知的DNA序列

结构与功能研究：首先获得全长的基因（cDNA），然后进行序列测定，比较GeneBank已知基因序列，确定该基因是否是新的基因。如果是已知基因，比较一下其结构，看是否有特殊的结构特征？进化上的保守性如何？生物学功能与疾病的关系？

1.分析新基因的DNA序列，与一些已知的高度保守的功能序列进行比较，推测它的基本功能

2.DNA杂交：用该基因片段作探针，与基因组DNA片段作杂交，测定它的拷贝数

3.mRNA表达的定量检测，确定它在各种组织，正常组织和疾病组织的表达量--相关性研究

4.Western 杂交，确定该蛋白的表达与各种组织，正常组织和疾病组织的关系

5.蛋白质的定位：该蛋白在不同组织和细胞的表达及分布，用该基因表达的蛋白产物，免疫动物获得的抗体，与细胞各组织，如细胞核、细胞膜、染色体、线粒体或叶绿体，进行免疫分析，确定该蛋白的定位。

6. 病理切片进行免疫组化分析，借助电子显微镜的分析，确定蛋白质的定位，帮助预测其功能

7.蛋白质DNA结合实验

8.蛋白产物生化性质分析研究