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蛋白电泳手册

SDS-PAGE及Westernblot

蛋白电泳

蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg)，分辨率高，凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。

PAGE原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。

SDS-PAGE原理

SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。实验使用过程中，还加入DTT或者***，以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。SDS—PAGE最常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶）。

索引

蛋白电泳（SDS-PAGE）……………………

电泳试剂总表……………………………………………………制胶………………………………

上样及电泳……………………

染色

蛋白提取

蛋白定量

Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明

BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明

Lowry蛋白浓度测定试剂盒使用说明

蛋白分子量标准（图）

考马斯蛋白胶快速染色液

Westernblot

WesternblottingDAB检测试剂盒

WesternblottingECL化学发光检测试剂盒

Westernblotting试剂盒使用说明

蛋白电泳试剂（部分试剂可以相互替换）系号

货号

名称

1

T8060

TRIS三羟甲基氨基甲烷

2

G8200

Glycine甘氨酸

3

S8010

SDS十二烷基硫酸钠

4

A8080

Acrylamide丙烯酰胺

5

M8200

N,N-MethyleneBisacrylamide甲叉双丙烯酰胺6

A8090

AmmoniumPersulfate过硫酸胺

7

D8220

DTT二硫苏糖醇

8

M8210

β-Mercaptoethanolβ-***

9

T8090

TEMED四甲基***

10

A1010

30%丙烯酰胺（29:1）

11

S1051

4XSDS-PAGE分离胶缓冲液（PH=8.8）12

S1052

4XSDS-PAGE浓缩胶缓冲液（PH=6.8）13

P1016

4×蛋白上样缓冲液(含β-***)

14

P1015

4×蛋白上样缓冲液(含DTT)

15

D1070

1MDTT

16

A1030

10%过硫酸氨

17

T1020

1MTris-HCL(PH6.8) 18

T1010

1.5MTris-HCL(PH8.8) 19

S1010

10%SDS

20

T1070

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液

SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，实验室可根据自己的情况和习惯来选择试剂。如选择1、2、3、4、5、6、7、8、9全部试剂可自己配制。也可以选择配制好的试剂。如10、11、12、13/14、16、9、20。还可选择10、13/14、16、9、17、18、19、20。

一，制胶

凝胶配制表（一）

分离胶12%

分离胶10%

分离胶8%

浓缩胶（3%）

总体积

10ml

5ml

4X分离胶缓冲液（PH8.8）

2.5ml

4X浓缩胶缓冲液（PH6.8）0

1.25

30%丙烯酰胺(29:1)

4ml

3.3

2.7

0.5

ddH2O

3.4ml

4.1ml

3.2ml

10%过硫酸铵

100ul

75ul

TEMED

10ul

7.5ul

凝胶配制表（二）分离胶12%

分离胶10%

分离胶8%

浓缩胶（3%）

总体积

10ml

5ml

30%丙烯酰胺(29:1) 4ml

3.3ml

2.7ml

0.5ml

1MTris-HCL(PH6.8) 0

0.625ml