细菌鉴定流程

细菌鉴定流程
细菌鉴定
细菌形态学鉴定16S rDNA 鉴定生理生化鉴定
一、细菌形态学鉴定
1.从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环
菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。

2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据
该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。

3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。

4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，
形状干湿透明度颜色边缘细菌大小
（mm）
注意事项：
①接种划线应在酒精灯旁边操作
②培养时应倒置培养，防止污染
二、革兰氏染色
1.涂片固定
将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。

注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。

固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2.染色
一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。

（2）加上碘液染色1分钟，水洗。

（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。

（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。

（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。

3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。

以均匀
分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。

注意事项：
①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。

若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。

②玻片通过火焰温度不能太高。

③碘液变透明，则不能使用。

④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。

三、16S rDNA 鉴定
（16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定
3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。

4. 沸水浴10min，12000rmp离心2min，取1.5ul上清作为模板，上下游引物各0.5ul加到23ul体系中，每个样品做3个平行，进行PCR 扩增。

注意事项：
①使用离心机时一定要配平，防止损坏离心机。

②实验前所用离心管、纯水、枪头要灭菌后使用。

（若结果不理想则用改良方法）
1．收集菌体，或直接从平板上刮取细菌（直径约1.5-2mm左右大小菌落的菌量），加入含20ul 0.1-0.5% Triton X-100的200ul PCR管中，充分重悬。

2．对于较难散开的细菌则可采用500ul体积（同样含0.1-0.5%Triton X-100），使用超声重悬（菌体相应增加），处理后取出20ul加入200ul
PCR管中。

3. 将上述PCR管置于沸水中水浴处理5分钟，短暂离心（约30s）后，取1ul作为模板加入20ul（或25ul）体系中，进行PCR扩增。

0.1-0.5% Triton X-100的配置：
①30%储备液的配置
Triton X-100 1.41ml
0.1mol/L PBS(pH=7.3) 3.64ml
充分混合后，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀，备用。

②用前取该储备液稀释至所需浓度，取1-5ul储备液加入300ul双蒸水中。

普通PCR体系：（23ul反应体系）50管×PCR体系配制
ddH2O 918.5ul
10×buffer 125ul
dNTP 100ul
rTaq 6.5ul
1.配制体系所用的200μl PCR管、1.5ml离心管、纯水、1ml枪头、
200μl枪头、10μl枪头均需灭菌，且在无菌操作台中操作。

2.配制体系前先将50个200μl的PCR管放在冰盒上预冷。

3.取一个无菌的1.5ml离心管，依次将药品加入管中，在漩涡混合
器上混合5~10秒。

4.每23μl分装入200μl PCR管中，放-20˚Ϲ备用。

5.使用体系之前先验证体系是否好用。

例如：取实验室已知菌加16s上下游引物进行PCR反应，电泳后凝胶成像系统观察是否有已知条带。

注意事项：
（1）10×buffer、dNTP、rTaq用完尽快放回-20˚Ϲ保存。

（2）无菌操作
PCR程序：
94˚Ϲ 5min
94˚Ϲ 30s
35个循环 55˚Ϲ30s
72 ˚Ϲ 1 min 30s
72 ˚Ϲ10 min
4 ˚Ϲ 1 min
PCR产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳
1.先安装配胶槽，再将梳子插到槽中
2.缓冲液的配制：
（1）50 ×TAE Buffer储备液
Tirs 12.1g 、Na2EDTA.2H2O 1.86g ，加30ml去离子水搅拌溶解，
加醋酸2.855ml充分混匀，去离子水定容至50ml。

（2）1×TAE Buffer
取10ml 50 ×TAE Buffer储备液加490ml的纯水，摇匀，待用。

3.配胶：
琼脂糖0.15g
缓冲液（1×TAE）15ml
加热煮沸3次
待温度降低到50˚Ϲ~60˚Ϲ时加入1滴核酸染液（GoldView）摇匀倒入槽内待胶凝固约30min。

4.拔出梳子，将凝胶放入水平电泳槽中，保证缓冲液没过梳孔。

5.上样：
（1）取3ul 标准 DNA Maker点入左边第一个梳孔，从左到右顺序点样。

（2）取一只塑料手套，将1ul 6×Loading buffer点到手套上（3）取3ul PCR产物与1ul 6×Loading buffer即3:1混匀点入梳孔。

6．盖上电泳槽盖子，恒压120V电泳，至溴酚蓝跑到胶的1/3处停止电泳（约20min），用凝胶成像系统进行采集观察，其浓度与DNA Maker 比较，即亮度和长度。

7. 如果与预测结果相同时，填写送出测序的单子，并联系北京华大基因有限公司，同时将至少40μl PCR产物放4˚Ϲ保存待测序公司来取样。

8.PCR产物送进行测序。

*注意事项：核酸染液属于致癌物质，配胶以及与胶有关的仪器一定要戴胶皮手套操作
测序结果分析：
将测序结果掐头去尾后在NCBI（/）网站上进行BLAST比对。

具体操作步骤如下：
粘该菌序列
可参照相似度95%以上为可信结果。

结合细菌形态学鉴定、革兰氏染色、16S rDNA比对结果初步判定该
菌是属于哪个属，进行以下实验。

四、生理生化鉴定
选用API相关菌属鉴定试剂盒，具体类型参照以下：
（1）API 20 E鉴定革兰氏阴性杆菌
（2）API Listeria 鉴定李斯特菌
（3）API 20 NE 鉴定非肠道革兰氏阴性杆菌
（4）API 20 C AUX 鉴定酵母菌
（5）API 20 A鉴定厌氧菌
（6）API Coryne 鉴定棒状杆菌
（7）API 50 CHB 鉴定芽孢杆菌
（8）API Campy 鉴定弯曲菌
（9）API Staph 鉴定葡萄球菌和微球菌
（10）API Strep 鉴定链球菌
（11）API 50 CHL鉴定乳酸杆菌
（12）API NH 鉴定奈瑟氏菌、嗜血杆菌、布兰汉球菌
检测方法：（具体参考说明书）
1.试剂条的准备：
准备培养盒（盘和盖子），向盘的蜂窝状孔中倒入约5ml蒸馏水或去离子水，创一种潮湿的环境。

将菌株参考号记录在托盘的长条上，从各个包装中取出试剂条，将试剂条放入培养盒中。

2. 接种物的准备：
用0.9%的生理盐水将培养板上的菌冲下收集（建议使用早期培养物18~24h），该菌悬液制备好后必须立即使用。

3. 试剂条的接种：
将菌悬液接种到微型管中，只填充试管部分，杯型器不填充（微型管留少许不充满）。

将试剂条稍前倾，将吸管或滴管的顶部靠在杯的侧面，以免管的底部形成气泡。

4. 用矿物油填充杯形器，形成凸出弯月面，以保证ADH和URE实验的无氧环境。

5. 在36˚Ϲ下培养18~24h。

五、药敏实验
1.将平板上纯化出的菌用2~3ml 0.9%灭菌生理盐水冲下，制成菌悬
液。

2.无菌条件下取100μl菌悬液到培养基平板上。

根据培养基的干湿
程度适当调整菌悬液的用量。

3.三角玻璃刀蘸酒精后，经过酒精灯高温灭菌，待火灭后温度降低
至20˚Ϲ左右，均匀涂布
4.将药敏纸片贴到平板上，每个平板上可贴4个药敏纸片，常用水
产药物：诺氟沙星（氟哌酸）、头孢曲松（菌必治）、庆大霉素、奥复星（氧氟沙星）、头孢哌酮、强力霉素、四环素、卡那霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、链霉素、吡哌酸、先锋霉素、
氨苄西林、青霉素、利福平、多粘菌素、磺胺甲基异恶唑
5.28℃恒温培养24h后测量抑菌圈直径大小。

注意事项：
①贴药敏纸片时字朝里
②正置培养
例如：
配制培养基
例如：NA固体培养基
（1）称取蛋白胨3.3g放入三角锥形瓶中。

（海水培养基加NaCl至终浓度为20‰）
（2）蒸馏水定容至100ml，并放入转子，用锡箔纸封口，记号笔标注时间名称。

（3）将三角锥形瓶放在磁力搅拌器上高温搅拌，待液体透明并大量气泡产生时迅速拿下（戴手套，防止烫伤），用吸铁吸出转子。

（4）将三角锥形瓶、装有平板的铁桶放入高压灭菌锅中，121℃灭菌15分钟。

（5）将灭好的培养基及铁桶迅速放到操作台中，紫外通风，待培养基温度不烫手时倒板（在酒精灯旁操作）。

（6）打开平板盖子，紫外线通风约30min，待凝固后盖上盖子，平板放4℃保存。

注意事项：
①操作台使用前喷酒精，用无菌棉擦干，紫外通风约30min。

②放入灭菌锅前装有平板的铁桶的排气孔处于打开状态，灭菌完应迅速关闭排气孔后放入操作台中。