细菌鉴定流程

细菌鉴定流程

细菌鉴定

细菌形态学鉴定16S rDNA 鉴定生理生化鉴定

一、细菌形态学鉴定

1.从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环

菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。

2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据

该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。

3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。

4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，

形状干湿透明度颜色边缘细菌大小

（mm）

注意事项：

①接种划线应在酒精灯旁边操作

②培养时应倒置培养，防止污染

二、革兰氏染色

1.涂片固定

将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。

注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2.染色

一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。

（2）加上碘液染色1分钟，水洗。

（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。

（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。

（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。

3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀

分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。

注意事项：

①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。

②玻片通过火焰温度不能太高。

③碘液变透明，则不能使用。

④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。

三、16S rDNA 鉴定

（16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定

3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。

4. 沸水浴10min，12000rmp离心2min，取1.5ul上清作为模板，上下游引物各0.5ul加到23ul体系中，每个样品做3个平行，进行PCR 扩增。

注意事项：

①使用离心机时一定要配平，防止损坏离心机。

②实验前所用离心管、纯水、枪头要灭菌后使用。

（若结果不理想则用改良方法）

1．收集菌体，或直接从平板上刮取细菌（直径约1.5-2mm左右大小菌落的菌量），加入含20ul 0.1-0.5% Triton X-100的200ul PCR管中，充分重悬。

2．对于较难散开的细菌则可采用500ul体积（同样含0.1-0.5%Triton X-100），使用超声重悬（菌体相应增加），处理后取出20ul加入200ul

PCR管中。

3. 将上述PCR管置于沸水中水浴处理5分钟，短暂离心（约30s）后，取1ul作为模板加入20ul（或25ul）体系中，进行PCR扩增。

0.1-0.5% Triton X-100的配置：

①30%储备液的配置

Triton X-100 1.41ml

0.1mol/L PBS(pH=7.3) 3.64ml

充分混合后，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀，备用。

②用前取该储备液稀释至所需浓度，取1-5ul储备液加入300ul双蒸水中。

普通PCR体系：（23ul反应体系）50管×PCR体系配制

ddH2O 918.5ul

10×buffer 125ul

dNTP 100ul

rTaq 6.5ul

1.配制体系所用的200μl PCR管、1.5ml离心管、纯水、1ml枪头、

200μl枪头、10μl枪头均需灭菌，且在无菌操作台中操作。

2.配制体系前先将50个200μl的PCR管放在冰盒上预冷。

3.取一个无菌的1.5ml离心管，依次将药品加入管中，在漩涡混合

器上混合5~10秒。

4.每23μl分装入200μl PCR管中，放-20˚Ϲ备用。

5.使用体系之前先验证体系是否好用。

例如：取实验室已知菌加16s上下游引物进行PCR反应，电泳后凝胶成像系统观察是否有已知条带。

注意事项：

（1）10×buffer、dNTP、rTaq用完尽快放回-20˚Ϲ保存。

（2）无菌操作

PCR程序：

94˚Ϲ 5min

94˚Ϲ 30s

35个循环 55˚Ϲ30s

72 ˚Ϲ 1 min 30s

72 ˚Ϲ10 min

4 ˚Ϲ 1 min

PCR产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳

1.先安装配胶槽，再将梳子插到槽中

2.缓冲液的配制：

（1）50 ×TAE Buffer储备液

Tirs 12.1g 、Na2EDTA.2H2O 1.86g ，加30ml去离子水搅拌溶解，

加醋酸2.855ml充分混匀，去离子水定容至50ml。

（2）1×TAE Buffer

取10ml 50 ×TAE Buffer储备液加490ml的纯水，摇匀，待用。

3.配胶：

琼脂糖0.15g

缓冲液（1×TAE）15ml

加热煮沸3次

待温度降低到50˚Ϲ~60˚Ϲ时加入1滴核酸染液（GoldView）摇匀倒入槽内待胶凝固约30min。

4.拔出梳子，将凝胶放入水平电泳槽中，保证缓冲液没过梳孔。

5.上样：

（1）取3ul 标准 DNA Maker点入左边第一个梳孔，从左到右顺序点样。

（2）取一只塑料手套，将1ul 6×Loading buffer点到手套上（3）取3ul PCR产物与1ul 6×Loading buffer即3:1混匀点入梳孔。

6．盖上电泳槽盖子，恒压120V电泳，至溴酚蓝跑到胶的1/3处停止电泳（约20min），用凝胶成像系统进行采集观察，其浓度与DNA Maker 比较，即亮度和长度。

7. 如果与预测结果相同时，填写送出测序的单子，并联系北京华大基因有限公司，同时将至少40μl PCR产物放4˚Ϲ保存待测序公司来取样。