网织血小板的检测方法及临床应用

网织血小板的检测方法及临床应用

肖成华1　李文倩2　冯建明2

[关键词]　网织血小板;血小板减少性紫癜

[中图分类号]　R466.6 [文献标志码]　B [文章编号]　100422806(2010)0720440202

网织血小板(reticulated platelet s,RP)是介于骨髓成熟的巨核细胞与成熟血小板之间的不成熟血小板,与网织红细胞一样都是刚从骨髓中释放出来的未成熟细胞〔1〕,胞质内含有少量mRNA,体积较大,蛋白质合成能力强〔2〕。用新亚甲蓝染料,呈现浅蓝色或深蓝色的网织状细胞而得名。RP能较好地反应骨髓血小板的生成状态。RP检测是分析血小板生成状态的有用指标,随着检测方法的不断改进,其在临床上应用更广泛,成为血小板减少症的病因诊断和治疗效果评价重要的指标。

1　RP的检测

1.1　人工计数

与网织红细胞的显微镜计数法相似,在低倍镜下每个视野计数10个血小板,同时计数网织血小板的个数,总共计数100个视野,算出RP的百分比。由于血小板中网状结构的颗粒非常小、数量又少,在普通光镜下检测非常困难,所以RP的检查很长时间未被临床应用。

1.2　流氏细胞仪测定

RNA可以被许多不同的核酸特异荧光染料染色,其中较好的为噻唑橙(t hiazole orange,TO)。1990年K ienast等用TO作为RNA的荧光染色,通过流式细胞仪能够比较容易地检测出含有RNA 的血小板。用该法测定50例正常人RP为(8.6±2.8)%(2.8%～15.8%),21例特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者RP明显增加,可达(24.9±1019)%(13.3%～57.1%)。此法对鉴定TO阳性血小板比较容易而准确,不足之处是需把TO和血小板共同孵育1h以上,时间较长,而且全血标本受网织红细胞的荧光干扰较大。

1995年Richards等在上述方法的基础上作了一些改进,将全血标本改为血浆,用缓冲液冲洗后,主要采取1%甲醛固定,再用TO染色,经流式细胞仪测定525nm波长处的荧光强度即为RP数,同时计数血小板总数即求出RP的比值。

1999年林悟等又进一步对TO法作如下改良:①血小板经过固定;②TO浓度需要稀释8倍;③染色时间60～120min,置于室温暗处;④染色时血小板数不受到影响;⑤用抗CD42b单克隆抗体集聚

1青海大学医学院(西宁,810001)

2青海省人民医院血液科

通信作者:冯建明,E2mail:fjmok@ 血小板。通过以上改良,TO法收到良好效果,但仍有操作复杂、费时之弊。

1.3　自动计数法

1995年渡道清明等建立了一种用奥黄O(Au2 ramine O,AO)作为RNA染色剂的RP自动化AO 计数法,主要将RP检测软件安装在自动网织红细胞检测仪上。具体方法是将外周血标本200μl吸入自动RP检测仪内,其中10μl用于检测,10μl的全血立即与40μl2.6%的AO溶液(95.9%乙二醇和1950μl稀释液)混合,短时间内血小板就被AO 染色。取2.4μl混合液进入测量室,用波长488nm 的氩激光照射即可自动检测前向散射光强度和荧光强度的散点分布图,前者散点为血小板总数,后者散点为RP数。这种方法精确度好,而且标本在4℃和22℃中可稳定保存12h。其最大特点是检测外周血标本仅80s即可检测完毕,为临床应用创造了条件。2000年Takubo等〔3〕使用该仪器同时测定了免疫性血小板减少性紫癜患者的RP%和大血小板(1arge platelet s,L P)水平,发现慢性免疫性血小板减少性紫癜患者的RP及L P显著高于正常对照组。

1.4　Sysmex XE2100测定

2004年日本Sysmex公司研制全自动血球分析仪XE22100,它是一种高档的用于常规检测的血细胞分析仪,其在流式细胞仪的基础上,通过设立、构建网织红细胞和RP的检测通道,并通过升级的软件系统进行不成熟血小板比值(immat ure plate2 let f raction,IPF)检测。不需要对全血进行预处理,可以快速检测RP,在临床有希望成为一种有效和实用的临床常规检测项目〔4〕。使用该方法测定IPF在48h以内有良好的重复性和稳定性。对照组IFP%为(1.1～6.1)%,平均值3.4%;急性ITP 组范围(9.2～33.1)%,平均值为22.3%;急性血栓性血小板减少性紫癜组范围(11.2～30.9)%,平均值为17.2%。并且随着疾病的治疗好转,IFP%下降〔5〕。

RP稳定性差,Osei2bimpong〔6〕通过对同一受试者新鲜样本及储存样本的IPF测定,发现贮存后样本的IPF改变了,新鲜和储存的IPF差异有统计学意义(P<0.01)。因此为了获得临床有效的IPF,用新鲜采集的标本进行检查是非常必要的。Maruyama等〔7〕采用全血的方法(t he whole blood

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met hod,WBM)和富含血小板血浆的方法(platelet rich plasma met hod,PRPM)不同的RP收集过程,通过流式细胞仪测定RP并做比较。结果显示两种方法具有良好、稳定的一致性。

虽然高档的血细胞分析仪已经使网织血小板的自动检测成为可能,但是该类型仪器价格昂贵,需要在某种专门的血细胞分析仪上加装专用软件才可检测RP%,这在多数医院是无法进行的。流式细胞仪对RP的检测目前仍然是检测网织血小板的主要仪器。

2　RP的临床应用

2.1　ITP

ITP是因血小板免疫性破坏,导致外周血中血小板减少,骨髓巨核细胞代偿性增加,释放到外周的RP增加,随着外周血小板的恢复,RP逐渐降低。对于临床表现典型的ITP患者,可以不进行骨髓检查,采用周围血RP计数辅助诊断,特别是对小儿ITP具有更加重要的意义〔8〕。ITP患者的RP、血小板平均容积(M PV)、分布宽度(PDW)、大血小板比率(P2L CR)及血小板相关抗体(PA Ig G)比正常对照组及血小板减少的其他患者明显升高(P<0.05)。RP、PA Ig G是诊断ITP比较敏感的指标。RP与ITP的诊断呈正相关(χ2=10.458,P =0.001)〔9〕。

2.2　造血干细胞移植

RP是造血干细胞移植中预测骨髓恢复的有效的指标,Michur等〔10〕研究发现在异体造血干细胞移植后10～26d RP由(2.9±1.7)%升至(13.6±614)%,在RP达到峰值后平均3d,外周血小板升至45.6×109/L,RP逐渐降低。表明RP在骨髓恢复时血小板计数增加前增加,而当血小板计数开始增加时,RP开始下降。

2.3　化疗后骨髓抑制及恢复的指标

近年来的研究结果表明外周血RP%、RP绝对值是反映急性白血病(AL)化疗后骨髓变化的一个早期且敏感的指标,AL患者化疗后RP增加,反映骨髓血小板生成能力较好,可为预测PL T恢复时间提供有价值的信息〔11〕。

2.4　在透析患者中的应用

血液透析和腹膜透析患者的RP明显高于正常对照组,而血小板总数无变化,提示血小板的更新加速可提供血小板的消耗〔12〕。

2.5　在肝移植中的应用

在原位肝移植的患者中,移植后外周血血小板计数在最初5d降至基值,而RP%逐渐升高,第2天由基点1.0%开始升高,在第6天至峰值为416%。当外周血PL T达到正常范围时(平均11d),RP%重新恢复至移植前水平。故认为肝移植后RP%的升高加速了外周血血小板的恢复,可作为移植后肝功能重建和血小板恢复的检测指标〔13〕。

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(收稿日期:2009207207)

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临床血液学杂志2010年7月第23卷第7期