荧光蛋白真核表达载体的构建及其瞬时表达

荧光蛋白真核表达载体的构建及其瞬时表达

孙婷婷a，高晓莲a，b

a浙江理工大学生物工程所，浙江杭州（310018）

b休斯顿大学生物学与生物化学研究所，美国TX77004-5001

E-mail:suntingting1218@

摘要：荧光蛋白易于和其他蛋白融合，且融合后的荧光蛋白仍能保持荧光激发活性的优点广泛地应用于细胞学，医学和分子学领域。然而，随着荧光蛋白研究方法的发展对荧光蛋白的种类也提出了更多的要求。而传统的获得荧光蛋白的方式主要局限于从生物体内直接提取或通过定点诱变和突变的技术获得，而对利用基因合成的方法合成新型荧光蛋白的研究则很少。本文基于微流体芯片合成获得新型荧光蛋白的基础上，构建真核质粒载体pcDNA3.1(+)-G2-hexaHis，通过转染进入HeLa细胞内进行表达，结果显示G2在真核细胞中可以大量表达，且荧光强度很强，亚细胞定位结果显示荧光蛋白G2绝大部分存在于细胞质中，极少部分分布在细胞核中，故荧光蛋白G2将成为真核细胞质中蛋白的定位，细胞骨架标记和细胞分裂，胞质蛋白表达强度等同时也可以应用于细胞核中特异蛋白的标记及核质间物质运输应用中很有潜力的工具。

关键词：真核载体构建；转染；亚细胞定位

荧光蛋白被证实是活体生物成像的良好工具，被广泛的应用于生物学的不同领域。例如细胞骨架和细胞分裂，细胞器动力学和囊泡运输，细胞核和细胞质之间的物质运输，蛋白质之间的互作，蛋白质定位，基因转录强度等的测定[1-4]。近几十年来，绿色荧光蛋白通过和其他蛋白融合标记不同蛋白的在亚细胞中的分布及动力学或标记细胞中的不同分区和器官[5,6]。而且随着荧光蛋白变体类型和数量的扩充，其荧光蛋白涉及的新的应用技术也不断展现，如荧光共振能量转移（FRET）、荧光双分子和多分子标记技术、双分子荧光互补技术、荧光双杂交技术（F2H）等[7-10]。

传统获得荧光蛋白变体的方法局限于通过从生物体直接提取或利用定点诱变和突变的方法获得，此方法不仅费时耗资金，且不能高通量获得目的荧光蛋白变体。而生物合成方法解决了这一难题，利用生物合成方法可以合成一些自然界不存在或常规方法难以获得的生物大分子，而微流体芯片合成技术在生物合成法的基础上得到了增进，其是一种简便、快捷、准确率高的生物合成技术[11,12]。本实验基于此技术合成的新型荧光蛋白（此结果将在英文期刊进行发表），构建真核载体，在Hela细胞中进行表达，结果显示新型荧光蛋白在HeLa 细胞可以得到大量表达，故其将成为生物学领域重要的工具。

1 材料和方法

1.1 质粒、感受态、细胞系

载体pcDNA3.1(+)-G2-Hexa His由本实验室构建；E.coli BL21感受态本实验室利用0.1 M CaCl2制备；HeLa细胞由本校新元医药研究所保存；G2本实验组微流体芯片从头合成荧光蛋白。

1.2 主要试剂

Deep VentR® DNA聚合酶（2 unit/µl，NEB），dNTP mixture（2.5 mM，TaKaRa），dATP （100 mM，Songon），T4 DNA连接酶(40 U/µl，NEB)， Bam HⅠ（10 U/µl，Fermentas），Xho I (10 U/µl，Fermentas)，Xba I（10 U/µl，Fermentas）；pcDNA3.1(+)载体系统（Promega），AxyPrep TM Gel Extraction Kit（Axygen），Microcon® YM-3（Millipore），DEME（GIBICO），

Fetal bovine serum（GIBICO），HE染色液（Beyotime），Hoechst染液（Beyotime），甘油及其他试剂均是国产分析纯。

1.3 仪器设备

PCR仪，水浴锅（Bioer），离心机（Eppendorf），电泳仪（Bio-RAD），凝胶成像系统（SynGENE），台式恒温振荡器（Vortex Genie2），恒温培养箱（Salvis Lab），超净台（Thermo electron corporation），二氧化碳孵箱（Thorma），荧光显微镜（Olympus），激光共聚焦显微镜（Nikon）。

1.4 真核载体的构建

为了获取目的荧光蛋白片段以便后续插入真核质粒载体，需设计引物从原核质粒载体pET-28a(+)-G2扩增出目的荧光蛋白片段。引物设计中为了保证扩增的效率我们选择了Bam HI和Xba I两个内切酶位点作为扩增和插入真核载体的位点（构建过程见图1）。

图1 pcDNA3.1(+)-G2-HexaHis载体构建过程

Fig.1 Construction of pcDNA3.1(+)-G2-HexaHis vector

1.5 引物设计及目的片段的扩增

鉴于扩增效率和保留组氨酸标签以备后续纯化的需要，选择了上下游酶切位点分别是Bam HI和Xho I两个酶切位点用于从原核载体pET-28a(+)-G2中置换出G2-HexaHis，插入到真核载体pcDNA3.1(+)上。具体引物序列设计如表1所示。

表5.1 用于插入真核质粒荧光蛋白特异性引物

Table 5.1 Specific primers of fluorescent protein gene used for inserting into eukaryotic plasmid Primer ID Sequence (5’-3’) Enzyme site

G2_05 TCGG GGATCC ATGAGCAAAGG Bam HI

G2_03 GGGG TCTAGA GTGGTGGTGGTGGT Xba I

以pET-28a(+)-G2载体为模板进行PCR扩增。PCR反应体系如下：pET-28a(+)-G2载体（20 g/µl）3 µl，上下游引物（100 µM）各1 µl，10×Thermal buffer 10 µl，dNTP（20 mM）10 µl，Vent DNA聚合酶（10U/µl）0.5 µl，加入无菌ddH2O至100 µl。PCR反应条件：94 ℃