免疫荧光双标法

免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用
陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴
作者单位：200080 上海市第一人民医院心血管外科
细胞性心肌塑型术（cellular cardiomyoplasty）用于缺血性心肌病的治疗受到人们越来越多的关注［1］，在证实移植的人干细胞在缺血/损伤的环境中分化为人心肌细胞方面，免疫荧光技术的运用逐渐增多，但多用的是新鲜冰冻切片，在石蜡心肌切片中应用较少，而且多是单一抗原的荧光标记［2］。

有研究表明，酪胺信号放大( tyramide signal amplifications, TSA)技术可以提高反应的灵敏性［3］。

为此，我们以人心肌石蜡切片标本为例，运用TSA－免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白(connexin-43，Cx-43)蛋白及肌凝蛋白（myosin）进行标记，旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。

一、材料与方法
1. 主要试剂：兔抗人肌凝蛋白（myosin）多克隆IgG抗体购自美国Chemicon 公司，标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP）的驴抗小鼠多克隆IgG抗体均购自美国Jackson Immunity 公司, 小鼠抗人Cx-43单克隆抗体、碘化丙啶(PI)与牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司，酪胺 (tyramide)-coumrian 结合物试剂盒购自美国PerkinElmer公司。

2．标本的取材、固定、切片及抗原修复: 人心肌取自一例6岁先天性心脏病小孩右房耳，中性福尔马林固定，4°C过夜固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 μm石蜡切片。

石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复：浸入 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 中，95℃，浸泡30 min, 室温冷却10 min。

3．Cx-43的免疫荧光标记：采用TSA-免疫荧光法［4］，按试剂盒说明书进行。

磷酸盐缓冲液（PBS）室温洗涤2次，每次5 min。

置入3% 过氧化氢/甲醇溶液中，室温，孵育10 min。

再室温PBS洗涤3次，每次5 min。

3%的BSA室温孵育30 min。

加入小鼠抗人Cx-43单克隆IgG抗体，4℃孵育过夜。

TnT缓冲液（ mol/L Tri-HCI, pH , mol/L NaCl, % 吐温-20）室温洗涤3次，每次5 min。

加入标记有HRP的驴抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h。

TnT液室温洗涤3次，每次5 min。

配制酪胺-coumrian 工作液：将酪氨-coumrian结合物加入放大缓冲液中配成酪胺-coumrian 工作液（1∶50），避光，室温孵育15 min。

再次TnT液洗涤3次。

4． Myosin的免疫荧光标记：接上一步。

采用间接免疫荧光法［5］。

兔抗人肌凝蛋白多
克隆IgG抗体（1∶20）， 37°C孵育1 h，PBS洗涤3次。

加入标记FITC的驴抗兔多克隆IgG抗体(1∶100)，避光，室温孵育1 h。

PBS室温洗涤3次，每次5 min。

5．PI染细胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS，1 μg/ml），室温避光孵育3 min。

PBS室温洗涤3次后甘油封片。

6．荧光显微镜观察：运用带有3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜镜检：绿通道中观察FITC信号；蓝通道中观察coumrian信号；红通道中观察PI信号。

图像的编辑采用Advanced SPOT 软件。

二、结果
在3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜中红、绿、蓝通道中分别可以观察到PI、FITC 及coumrian的信号，再经Advanced SPOT 软件叠加得到图1~4，红色代表PI标记的人心肌细胞核，绿色代表FITC标记的人心肌肌凝蛋白蛋白，蓝色为coumrian标记的人心肌Cx-43蛋白。

图1显示为未加myosin抗体而加Cx-43抗体的人心肌石蜡切片; 图2中均加myosin 抗体与Cx-43抗体; 图3中加myosin抗体而未加入Cx-43抗体；图4均未加入 myosin抗体与Cx-43抗体。

三、讨论
1.心肌石蜡切片的免疫荧光双标记：在本研究中，图1与图2相比，人心肌石蜡切片中，不加myosin抗体的心肌纤维不着色，而加了myosin抗体的心肌纤维呈绿色，这表明心肌纤维被成功地标记上抗人myosin抗体，而且特异性高。

Cx-43蛋白位于心肌细胞的周围，在本研究中由图1、图2与图3可以观察到，加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白呈
图1人心肌石蜡切片未加肌凝蛋白抗体而加Cx-43抗体，PI复染×200 图2人心肌石蜡切片均加肌凝蛋白抗体与Cx-43抗体，PI复染×200 图3人心肌石蜡切片加肌凝蛋白抗体而未加Cx-43抗体，PI复染×200 图4人心肌石蜡切片均未加肌凝蛋
白抗体与Cx-43抗体，PI复染×200
蓝色，而未加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白不着色, 这表明心肌成功被标记上抗人Cx-43抗体。

图2与图4相比，加入2种抗体，人心肌纤维与 Cx-43蛋白均着色，而不加抗体者
均不显色；这说明本研究在人心肌石蜡切片中采用的免疫荧光双标记的方法是成功的，而且特异性高。

在本研究中，标记myosin 采用间接免疫荧光技术，这种方法较直接免疫荧光技术灵敏。

在本研究中，两种一抗分别来源于兔与小鼠，由于二抗是多克隆的，都可以与两种一抗结合，故必须是先标记Cx-43后再标记myosin，不能将两种二抗混合在一起加入，否则会出现交叉污染。

2.本研究方法有以下优点：（1）特异性较单荧光标记强。

在细胞性心肌塑型术中单荧光标记有一定的假阳性率，而采用本研究的双荧光法，能同时观察到
移植的人的干细胞表达两种心肌抗原，假阳性率大大减低。

（2）目前，报道的人心肌免疫荧光双标记的方法较少，而且多需要特殊的设备如激光共聚焦扫描显微镜等［7］，本研究仅用普通的荧光显微镜就可以，易于掌握、使用方便。

3．心肌石蜡切片免疫荧光双标记的意义：成体心肌细胞再生能力非常弱［6］，移植干细胞到缺血/损伤的心肌内，以便参与心肌的修复与再生是当前国内外研究的热点［7］。

由于不同种属来源的干细胞的分化能力有较大的差异［8］，因此，人的干细胞在运用于临床之前，还需要将人的干细胞植入动物心肌内，以观察植入的人干细胞是否分化为人的心肌细胞［9］。

同新鲜冰冻切片相比，石蜡切片可以保持良好的组织形态，但在石蜡切片中运用免疫荧光检出抗原信号的灵敏性明显减低。

myosin是心肌肌纤维的重要组成部分，Cx-43又称为闰盘、缝隙连接蛋白。

如果观察到移植的人干细胞表达myosin与 Cx-43，那么就可以认定移植的人干细胞向人心肌细胞分化，而且可以在心肌细胞的电兴奋活动中与其他心肌细胞协同收缩［6］。

本研究建立了一种人心肌石蜡切片荧光双标记的方法，我们相信这种方法将在研究人的干细胞移植和心肌的修复与再生方面发挥重要作用。

参考文献
1 Chen XJ，Xiao MD. Cell transplantation for heart repair. Guowai Yixue Section
of Pathophysiol Clin Med，2003，23：47-49.
陈绪军，萧明第.细胞移植修补心脏.国外医学生理病理与临床分册，2003，23：47-49.
2 Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M, et al. Human embryonic stem cells can
differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest, 2001，108:407-414.
3Howard M, Kaplan D. Applications of enzymatic amplification staining in immunophenotyping hematopoietic cells. Front Biosci, 2002，7:c33-43.
4 Zaidi AU, Enomoto H, Milbrandt J, et al. Dual fluorescent in situ hybridization
and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. J Histochem Cytochem, 2000 , 48，1369-1375.
5 Doucet L, Mendes F, Montier T, et al. Applicability of different antibodies for
the immunohistochemical localization of CFTR in respiratory and intestinal tissues of human and murine origin. J Histochem Cytochem. 2003 , 51:1191-1199.
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Cardiovascular Dis， 2002，29：199-202.
陈绪军，萧明第.心肌细胞能够再生.国外医学心血管分册，2002，29：199-202.
7 Chen XJ，Xiao MD. The proceedings of differentiations of stem cells into
myocardial cells. Guowai Yixue Section of Pathophysiol Clin Med, 2002，22：429-431.
陈绪军，萧明第.干细胞分化为心肌细胞的研究进展.国外医学生理病理与临床分册，2002，22：429-431.
8 Gepstein L. Derivation and potential applications of human embryonic stem cells.
Circ Res,2002 ，91:866-876.
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Circulation, 2002，105: 93-98.
我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。

我的经验是：
（1）选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

（2）我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。

抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

（3）我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

（4）封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。

（5）其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

注意几点：
1）最好是不同种属来源的一抗，而且最好都是单抗。

这样就要选择相应不同种属来源的二抗，避免同种属来源的二抗与两个一抗的交叉反应。

选择单抗也是避免交叉反应和假阳性。

好的抗体真的还是很重要。

2）如果条件所限，只找到一种抗体，而且说明书没有明确说可以做免疫荧光怎么办？
这个可能不是说就一定不能做，也可能是厂家没做这方面的实验，可以大胆的try
3)为何免疫双标一般是免疫荧光为主？
一方面是不同抗体标记不同的荧光，图片漂亮；另一方面也是为了避免SP和ABC法中还要封闭内源性过氧化物酶等可能会引起假阳性反应。

4）是否可以用不同荧光染料直接标记的不同一抗来做？
可以做，过程还可省一步。

但是注意没有二抗的放大效应，结果可能有时很难出来。

5）免疫双标荧光的图像如何整合？
可以用扫描共聚焦，或者用园子的软件整合。

注意及时照相，荧光过段时间会淬灭。

免疫双标中，最为关键的是一抗、二抗的选择以及恰当的搭配：
1. 免疫双标做得好的基本原则是：一抗种属不同，二抗匹配对应的一抗，二抗不同颜色标记，二抗之间无交叉反应
2. 抗体的选择一般根据本实验相关的一些关键词（抗体名称、编号、目标动物种属、实验方法...）来检索一些档次较高的文献，看看图片较好的文献中研究者们用的哪个公司的什么编号抗体，不见得知名公司的抗体就一定做得出来，实践检验过了的才是金标准。

3. 封闭液的选择封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色的抗原。

所以，封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。

比如，二抗是“驴抗羊FITC、驴抗兔CY3”，那么最佳封闭液就是驴血清封闭液。

免疫双标一抗的选择主要有两种形式:
第一：一抗种属来源相同：即一抗A和B都是小鼠抗大鼠，或者都是兔抗大鼠；对于这种情况，采用的双标方法是顺序法，即把免疫组化的过程走两遍，一抗不能同时加。

第二：一抗种属来源不同：比如一抗A是小鼠抗大鼠，一抗B是兔抗大鼠，即A 的种属来源是小鼠，B的种属来源是兔；针对的组织是大鼠。

对于这种情况，就可以两种一抗一起加了，减少了步骤，避免了很多麻烦。

之所以这样做，主要就在于二抗的选择上：
对于第一种情况，二抗只能选择抗小鼠的，或者都是抗兔的，如果同时加，就会出现交叉反应，得到不可靠的结果。

对于第二种情况，二抗选择就可以分为抗小鼠和抗兔，这样的话，抗小鼠的二抗就只能跟小鼠抗的一抗A结合，抗兔的二抗就只能跟兔抗的一抗B结合了，避免了交叉反应。

二抗的封闭血清选择和二抗的种属来源选择问题：
问题1
组织：大鼠
一抗：A（小鼠抗大鼠），B（兔抗大鼠）
二抗：A（羊抗小鼠），B（羊抗兔）
请问：二抗这样选择是否可行，为什么
回答：这种是最常见的，也是最简单易行的。

此时做荧光双标较理想，如二抗A 选择羊抗小鼠的Cy2 (绿光), 二抗B选择羊抗兔的Cy3 （红光）。

一般来说，此种情况下，两个一抗可以一起孵育，两个二抗也可以一起孵育。

封闭液就选择针对二抗的羊血清。

一般是用10% normal goat serum 30min 37度。

这种情况选羊的或者驴血清都可以。

问题2
组织：大鼠
一抗：A（小鼠抗大鼠），B（兔抗大鼠）
二抗：A（羊抗小鼠），B（驴抗兔）
请问：此时的封闭血清该如何选择
回答：选择BSA，但是BSA也不是万能的，但是不能选择大鼠血清。