皮肤科细胞培养及临床应用 PPT课件
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大规模培养细胞，获得分泌产物
2020/10/31
21
无血清培养基的组成
基础培养基 HamF12 : DMEM = 1 : 1
添加组分
层粘连 胞，如大
2020/10/31
促贴壁物质（细胞外基质，如纤连蛋白,
蛋白） 促生长因子及激素 酶抑制剂（终止胰酶消化作用，保护细
……
豆胰酶抑制剂）
22
更换无血清培养基的注意事项
血清
基本培养基(通用培养基) 培养基
完全
2020/10/31
10
基本培养基的组分
四大类物质
物 pH指示剂
无机盐 酚红
氨基酸 维生素 碳水化合
2020/10/31
11
常用基本培养基
RPMI 1640
DMEM 糖， 1000g/L葡萄糖
HamF12 基础培养
2020/10/31
199
应用最广泛 高糖型 4500g/L 葡萄
存, 避免反复冻融
-20 ℃长期贮
4 ℃, < 1个月
融化步骤: -20 ℃ 室温
4℃
使用浓度: 5%～20%, 常用10%
基中
2020/10/31
临用前添加于培养
20
无血清培养基
用途
观察生长因子对细胞的作用,需排除其 它生长因子的干扰作用
测定细胞在培养过程中分泌某种物质 （抗体、生长因子）的能力
皮肤病学相关研究中 所涉及的细胞培养问题
2004年2月
2020/10/31
1
一. 细胞培养涉及的基本知识
2020/10/31
2
最常见的两种生长型细胞
贴壁依赖性细胞(Anchorage-dependent cells)
贴附于不起化学作用的物质(玻璃、 或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和 维持。
悬浮培养细胞(Suspension culture)
细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基 中增殖。
2020/10/31
3
细胞培养中常用的几个术语
细胞系(Cell line)：
原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。
连续传代
连续传代
连续细胞系
(已建成的细胞系)
有限细胞系
2020/10/31
4
细胞株(Cell strain):
针对性强 直接适应 连续适应
逐步降低血清浓度
2020/10/31
23
无蛋白培养基(PFM)
不含动物蛋白的培养基，以添加植物水解物 替代动物激素、生长因子。
用途
生物技术产品生产
2020/10/31
24
限定化学成分培养基(CDM)
培养基中所有成分明确，不含动物蛋白， 也 不添加植物水解物，而使用一些已知结构与功能 的小分子化合物(短肽、植物激素等)。
培养。
传代培养(Passage)(Subculture)
细胞从一个培养器皿转移至另一个培养 器皿
中培养。
再培养(Reculture)
养基
2020/10/31
单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培
8
集落形成率(Plating efficiency)
细胞接种到培养器皿内所形成的集落的百 分率。
单个细胞 (Cloningefficiency)
细胞融合(Cell fusion)
体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物 理方法诱发，使不同体细胞融合成杂交细胞 (Hybrid)。
细胞汇合(Confluence)
器皿中培养的细胞彼此汇合形成单层。
2020/10/31
7
原代培养(Primary culture)
从直接取自生物体细胞、组织或器官开 始的
由具有某些特性与标志的细胞选择或克 隆化而派生的亚系。
细胞周期(Cell cycle)
细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结 束所经历的时相过程。
4个时期：S期：DNA合成期
M期：有丝分裂期
开始的间隙期
G1期：有丝分裂完成至DNA合成
G2期：DNA复制结束至有丝分裂
开始的间隙期
周期进行，进入
2020/10/31
用 用 受的机 2020/10/31
抗蛋白酶成分对细胞释放的蛋白酶起中和作 终止贴壁细胞消化传代中所用胰蛋白酶的作 血清蛋白的粘度保护悬浮培养搅拌时细胞所
17
使用血清的缺点
改变细胞在体内的正常状态 促进某些细胞生长同时抑制另一类细 胞生长。 所含物质对细胞生长的影响或毒性作 用 批间成分的一致性 支原体、病毒的潜在污染性
2020/10/31
18
血清质量的判断 质量鉴定报告 理化性质 微生物检测 促生长效果(培养细胞检测)
克隆形成率、贴壁率测定 连续传代培养
外观判断
透明清亮 土黄色或棕黄色 无沉淀或及少量沉淀 较粘稠
2020/10/31
19
血清的使用与贮存
灭活处理: 56℃水浴, 30分钟(去除补 体)
贮存条件: 分装
集落
克隆形成率
群体密度(Population density)
培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞 数(细
胞数/cm2)。
饱和密度(Saturation density)
2020/10/31
特定条件下，培养器皿中能达到的最高细9
培养基
培养基
天然培养基 合成培养基
基本培养基(通用培养基)(MEM ) 无血清培养基 无蛋白培养基
牛血清
生牛。 刺方
小牛血清：取自出生10～30天的小牛。 新生牛血清：取自出生24小时之内的新
胎牛血清：取自剖腹产的胎牛或心脏穿
法获得。
2020/10/31
16
血清的主要作用
提供细胞生长所需的基本营养物质。
生长因子、结合蛋白)
(激素、
提供贴壁和扩展因子 (纤连蛋白,层粘连 蛋白)。
对培养中的细胞提供保护作用。
2020/10/31
14
培养基添加成分
NaHCO3
一般按说明书要求添加
封闭式培养用5.6%或7.4%液调 节
谷氨酰胺
易降解，使用前添加
使用终浓度0.002mol/L
HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)
变动
主要作用为防止培养基pH迅速
2020/10/31
使用终浓度0.01- 0.015mol/L
15
完全培养基的添加成分
G0期：某种原因导致细胞不再沿
休眠状态
5
细胞一代时间(Cell generation time)
单个细胞两次连续分裂的时间间隔。
群体倍增时间(Population doubling time)
在对数生长期进行计算的细胞增加一 倍所
需要的时间。
2020wenku.baidu.com10/31
6
克隆(Clone)
单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体， 它们的遗传特性相同。
低糖型
无血清培养基常用的 基
12
培养基的选择
培养细胞的首选培养基 常用培养基 根据细胞株特点、实验需要选择 用生长曲线、集落形成率等指标选择
2020/10/31
13
培养基配制时的注意事项
严格按说明书要求添加必要成分 NaHCO3 谷氨酰胺 HEPES ------
各成分顺序溶解 配制培养基用水、器皿 灭菌 分装、保存
2020/10/31
21
无血清培养基的组成
基础培养基 HamF12 : DMEM = 1 : 1
添加组分
层粘连 胞，如大
2020/10/31
促贴壁物质（细胞外基质，如纤连蛋白,
蛋白） 促生长因子及激素 酶抑制剂（终止胰酶消化作用，保护细
……
豆胰酶抑制剂）
22
更换无血清培养基的注意事项
血清
基本培养基(通用培养基) 培养基
完全
2020/10/31
10
基本培养基的组分
四大类物质
物 pH指示剂
无机盐 酚红
氨基酸 维生素 碳水化合
2020/10/31
11
常用基本培养基
RPMI 1640
DMEM 糖， 1000g/L葡萄糖
HamF12 基础培养
2020/10/31
199
应用最广泛 高糖型 4500g/L 葡萄
存, 避免反复冻融
-20 ℃长期贮
4 ℃, < 1个月
融化步骤: -20 ℃ 室温
4℃
使用浓度: 5%～20%, 常用10%
基中
2020/10/31
临用前添加于培养
20
无血清培养基
用途
观察生长因子对细胞的作用,需排除其 它生长因子的干扰作用
测定细胞在培养过程中分泌某种物质 （抗体、生长因子）的能力
皮肤病学相关研究中 所涉及的细胞培养问题
2004年2月
2020/10/31
1
一. 细胞培养涉及的基本知识
2020/10/31
2
最常见的两种生长型细胞
贴壁依赖性细胞(Anchorage-dependent cells)
贴附于不起化学作用的物质(玻璃、 或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和 维持。
悬浮培养细胞(Suspension culture)
细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基 中增殖。
2020/10/31
3
细胞培养中常用的几个术语
细胞系(Cell line)：
原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。
连续传代
连续传代
连续细胞系
(已建成的细胞系)
有限细胞系
2020/10/31
4
细胞株(Cell strain):
针对性强 直接适应 连续适应
逐步降低血清浓度
2020/10/31
23
无蛋白培养基(PFM)
不含动物蛋白的培养基，以添加植物水解物 替代动物激素、生长因子。
用途
生物技术产品生产
2020/10/31
24
限定化学成分培养基(CDM)
培养基中所有成分明确，不含动物蛋白， 也 不添加植物水解物，而使用一些已知结构与功能 的小分子化合物(短肽、植物激素等)。
培养。
传代培养(Passage)(Subculture)
细胞从一个培养器皿转移至另一个培养 器皿
中培养。
再培养(Reculture)
养基
2020/10/31
单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培
8
集落形成率(Plating efficiency)
细胞接种到培养器皿内所形成的集落的百 分率。
单个细胞 (Cloningefficiency)
细胞融合(Cell fusion)
体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物 理方法诱发，使不同体细胞融合成杂交细胞 (Hybrid)。
细胞汇合(Confluence)
器皿中培养的细胞彼此汇合形成单层。
2020/10/31
7
原代培养(Primary culture)
从直接取自生物体细胞、组织或器官开 始的
由具有某些特性与标志的细胞选择或克 隆化而派生的亚系。
细胞周期(Cell cycle)
细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结 束所经历的时相过程。
4个时期：S期：DNA合成期
M期：有丝分裂期
开始的间隙期
G1期：有丝分裂完成至DNA合成
G2期：DNA复制结束至有丝分裂
开始的间隙期
周期进行，进入
2020/10/31
用 用 受的机 2020/10/31
抗蛋白酶成分对细胞释放的蛋白酶起中和作 终止贴壁细胞消化传代中所用胰蛋白酶的作 血清蛋白的粘度保护悬浮培养搅拌时细胞所
17
使用血清的缺点
改变细胞在体内的正常状态 促进某些细胞生长同时抑制另一类细 胞生长。 所含物质对细胞生长的影响或毒性作 用 批间成分的一致性 支原体、病毒的潜在污染性
2020/10/31
18
血清质量的判断 质量鉴定报告 理化性质 微生物检测 促生长效果(培养细胞检测)
克隆形成率、贴壁率测定 连续传代培养
外观判断
透明清亮 土黄色或棕黄色 无沉淀或及少量沉淀 较粘稠
2020/10/31
19
血清的使用与贮存
灭活处理: 56℃水浴, 30分钟(去除补 体)
贮存条件: 分装
集落
克隆形成率
群体密度(Population density)
培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞 数(细
胞数/cm2)。
饱和密度(Saturation density)
2020/10/31
特定条件下，培养器皿中能达到的最高细9
培养基
培养基
天然培养基 合成培养基
基本培养基(通用培养基)(MEM ) 无血清培养基 无蛋白培养基
牛血清
生牛。 刺方
小牛血清：取自出生10～30天的小牛。 新生牛血清：取自出生24小时之内的新
胎牛血清：取自剖腹产的胎牛或心脏穿
法获得。
2020/10/31
16
血清的主要作用
提供细胞生长所需的基本营养物质。
生长因子、结合蛋白)
(激素、
提供贴壁和扩展因子 (纤连蛋白,层粘连 蛋白)。
对培养中的细胞提供保护作用。
2020/10/31
14
培养基添加成分
NaHCO3
一般按说明书要求添加
封闭式培养用5.6%或7.4%液调 节
谷氨酰胺
易降解，使用前添加
使用终浓度0.002mol/L
HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)
变动
主要作用为防止培养基pH迅速
2020/10/31
使用终浓度0.01- 0.015mol/L
15
完全培养基的添加成分
G0期：某种原因导致细胞不再沿
休眠状态
5
细胞一代时间(Cell generation time)
单个细胞两次连续分裂的时间间隔。
群体倍增时间(Population doubling time)
在对数生长期进行计算的细胞增加一 倍所
需要的时间。
2020wenku.baidu.com10/31
6
克隆(Clone)
单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体， 它们的遗传特性相同。
低糖型
无血清培养基常用的 基
12
培养基的选择
培养细胞的首选培养基 常用培养基 根据细胞株特点、实验需要选择 用生长曲线、集落形成率等指标选择
2020/10/31
13
培养基配制时的注意事项
严格按说明书要求添加必要成分 NaHCO3 谷氨酰胺 HEPES ------
各成分顺序溶解 配制培养基用水、器皿 灭菌 分装、保存