氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌
用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌制备感受态细胞1.从37℃培养16-20h的平板中调取一个单菌落(直径2-3mm),转到一个含有25mlLB培养基的烧瓶中.于37℃剧烈振摇培养3h.一般经验,1OD约含有大肠杆菌DH1 109个/ml。
2.将细菌转移到一个无菌﹑一次性使用的﹑用冰预冷的4ml的离心管中,在冰上放置10min,使培养物冷却至0℃。
3.于4℃以、4100r/min离心10min,以回收细胞。
4.倒出培养液,将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
5.每4ml初始培养液用 2.4ml预冷的0.1mol/LCaCL2-MgCL2溶液(80mmol/LMgCL220mmol/L CaCL2)重悬每份细胞沉淀。
冰上放置20分钟6.于4℃以4100r/min离心10min,以回收细胞。
7.倒出培养液,将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
8.每4ml初始培养液用160ul(加48微升的50%甘油)预冷的0.1mol/LCaCL2重悬每份细胞沉淀。
9.此时,可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化试验,也可以将细胞冻存于-70℃80mmol/L MgCL220mmol/L CaCL2500ml 1.47g Cacl2.2H2O + 8.132g MgCl2.6H2O0.1mol/LCaCL2+15%甘油 500ml 7.3505g Cacl2.2H2O + 75mL 甘油初始菌液40ml 24ml 80mmol/L MgCL220mmol/L CaCL2初始菌液40ml 1.6ml 0.1mol/LCaCL2+15%g甘油。
大肠杆菌感受态细胞-CaCl2制备
用CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞1. 仪器耗材仪器:冷冻离心机,恒温振荡器,超净工作台,紫外分光光度计。
耗材:玻璃试管,锥形瓶,50ml聚丙烯管(预冷),冰盒,1.5ml离心管,液氮。
2. 试剂及配制LB培养基(100ml):胰化蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,NaCl 1g,定容至100ml,高压灭菌,备用。
0.1mol/L的CaCl2-MgCl2:76g MgCl2,22.2gCaCl2,定容至1L。
0.1mol/L 的CaCl2:取出1mol/L的CaCl2(11.1gCaCl2加入到100ml四蒸水中)灭菌贮存液10ml加90ml灭菌水稀释至100ml。
1mol/L的CaCl2贮存液事先0.22微米滤膜过滤除菌,后保存于4℃。
3. 实验步骤(1)从37℃培养16-20h 平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm),转到一个含有4ml LB 培养基的玻璃试管中,37℃,250rpm振摇过夜培养。
(2)将过夜培养物以1:100的比例转接到含有100ml LB培养基的锥形瓶(500ml)中,37℃,250rpm振摇培养至对数生长期,一般需1.5-3h。
(3)将培养物转移到无菌、冰预冷的2个50ml聚丙烯管中(不要装太满以防离心管破裂),冰上放置10min。
(4)4℃,4100rpm离心10min,以回收细胞。
(5)倒出培养液,将试管倒置1min,以使最后的痕量培养液流出。
(6)沉淀用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2-MgCl2(每50ml初始培养液用30ml)溶液重悬。
(7)4℃,4100rpm离心10min,倒出培养液(方法同5),回收细胞。
(8)每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1mol/L 的CaCl2重悬沉淀。
(9)每2ml重悬细胞液加70μl DMSO(二甲基亚砜),轻轻旋转混匀之,将悬液置于冰上15min。
(10)每2ml细胞悬液再加70μl DMSO,轻旋混匀,至于冰上15min;(11)迅速将悬液以50-100μl每份分装到冷却的无菌1.5ml离心管中,用封口膜封口,投入液氮中快速冷冻(约1min),贮存于-80℃冰柜。
感受态制备
3.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)最终实验步骤:1,从DH5α平板上挑取单菌落,于5ml LB培养基中过夜培养。
2,取100ul细菌加入10mL LB培养基中,以220转/分的速度约摇动3-5小时,使OD600在0.4~0.5之间。
3,冰预冷细胞约30min。
4,4℃离心4000rpm,15~20min,弃上清。
5,倒掉上清后,用2ml冰预冷的0.1M/L CaCl2悬浮细菌,在冰上放置30min。
6,重复4,5步骤两次7,3000rpm离心10min,用400μl冰预冷的0.1M/L CaCl2轻柔重悬细菌。
8,每个1.5mL的Eppendorf 管分别放入100ul 细菌后,立即用于转化。
如需长期保存则每管需含有15%的甘油DH5a制备化学感受态细胞应该不是太麻烦,一般用CaCl2的方法,就是注意其中几点:1.所用试剂必须是最高级别的,包括水,最好是Milli-pore级别的。
2.所用器皿,枪头,离心管,还有你的甘油等必须严格灭菌,因为你的培养基是不含Amp 的,再说,你的感受态细胞很脆弱。
经不起大风大浪。
3.关键一点:步步不离冰。
温度波动会影响到你的成功率。
4.离心后回融不要剧烈震荡,始终记住,感受态细胞的脆弱性。
经不起折腾。
经验人士告诉我可以用枪轻轻吹打。
5.保证你培养的大肠杆菌OD值在0.5左右。
别让细胞长老了。
6.可以先在超低温冰箱中用离心管盒放一些乙醇(工业酒精即可)预冷,分装后将离心管插入超低温冰箱的乙醇中保存即可。
感受态制备的疑点:A)细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600来控制。
DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml);B)所有操作均应在无菌条件和冰上进行;C)经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的);D)化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如Mn2+或Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(100-1000倍);E)所使用的器皿必须干净。
大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)实验目的1.掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
2.了解大肠杆菌感受态细胞的生理特性和制备原理。
实验原理受体或宿主细胞容易接受外源DNA的状态称为感受态,通过物理或化学的方法,人工诱导细胞成为敏感的感受态细胞,以便外源DNA 进入,从而实现外源DNA在宿主细胞内大量复制和表达。
在低温、低浓度CaCl2的作用下,大肠杆菌细胞膜的磷脂双分子层形成液晶结构,细胞外膜和细胞内膜间隙中的部分核酸酶解离,细胞膜的通透性增加,此时大肠杆菌成为感受态细胞。
实验器材高温高压灭菌锅、超净工作台、牙签、移液器、移液器吸头、离心管、离心管架、EP管、恒温摇床、恒温培养箱、三角瓶、培养皿、离心机、制冰机等。
实验试剂(1)培养基:LB,LA。
(2)溶液:10%甘油+0.1mol/L CaCl2溶液,0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液。
(3)菌株:E.coli DH5α。
实验操作(1)用灭菌的牙签蘸取少量E.coli DH5α菌液划线接种于LA 培养基上,放在恒温培养箱37℃培养后,挑取单菌落接种于10ml LB 培养基中,于37℃摇床、200rpm过夜培养。
(2)按1∶100的接种比例将过夜培养的菌液转接至100~200ml 的LB培养基中,于37℃摇床、200rpm培养3~4h,使菌液的OD600达到0.6~0.8。
(3)冰浴菌液30min,同时将灭菌过的离心管、移液器吸头、“10%甘油+0.1mol/L CaCl2”溶液等放进冰箱预冷,在超净工作台中将菌液分装到预冷的50ml的离心管中,于4℃离心机中4000rpm离心15min。
(4)离心后尽量除去培养液,用预冷的“0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液”重悬菌体,冰浴25min后,于4℃离心机中4000rpm离心15min。
(5)离心后弃去上清液,重复步骤(4)一次。
(6)弃去上清液后,将菌体重悬于冰冷的“10%甘油+0.1mol/LCaCl2溶液”中,按每管80μl分装至预冷的灭菌的EP管中,-80℃保存备用。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法)细胞经过一些特殊方法(电击法、CaCl2法)等处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞,即感受态细胞(Compenent cells)。
1实验方法原理:带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材:E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤:1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm),转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验,1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头(或与之相当的转头)以4 100 r/min离心10 min,以回收细胞。
4、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头(或与之相当的转头)以41 00 r/min离心10 min,以回收细胞。
7、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5大肠杆菌感受态细胞的制备、转化与鉴定
五、重组子的筛选
1、耐药性基因
2、蓝白斑筛选
大肠杆菌感受态细胞的 制备、 制备、转化与鉴定
Байду номын сангаас 一、目的
把体外重组的DNA 引入 受体细胞
二、原理
(一)遗传物质的传递 (二)受体菌的选择与改造
三、感受态细胞的制备
氯化钙法: 1、划平板培养菌种 2、挑单菌落培养过夜 3、菌体的扩大培养
以下步骤均在冰浴中进行
4、.4℃离心,4000rpm×10min,弃去上 清,用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮 30min 5、.4℃离心,4000rpm×10min,弃去上清, 加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬 浮。 以100μl/管分装入1.5ml离心管中, -70℃冻存备用。
四、感受态细胞的转化
1、取100μl贮存于-70℃钙化菌, 冰浴化开; 2、加入适量连接产物,轻混匀,冰 浴20min; 3、于42℃热休克90s,迅速转移至 冰浴中,继续冰浴2-3min;
4、.加入LB液体培养基200μl,于37℃缓 摇孵育45min; 5、将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板 (根据质粒性质添加抗生素或/和XGal/IPTG),待胶表面没有液体流动 时,37℃温箱倒置培养12-16hr。
大肠杆菌感受态的制备的操作流程
大肠杆菌感受态的制备的操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成,希望大家下载以后,能够帮助大家解决实际的问题。
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CaCl2法制备感受态细胞-1
CaCl2法制备感受态细胞1)从新划线的平皿上挑取一个单菌落接种到10ml的LB培养基中于37℃过夜培养2)吸取500μl上述过夜培养的新鲜菌液,接种到一个盛有50ml LB的锥形瓶中,在37℃,200rpm条件下振荡培养直至菌浓度达到5×107个/ml,对大多数大肠杆菌菌株来说这时的OD600值为0.4~0.5。
一般从转接到达到此OD值约需2.5―3小时。
3)将培养液转至一灭菌并已预冷的50ml离心管(聚丙烯管)中于冰上放置10min,使培养物冷却至0℃。
4)然后于4℃以3000 rpm离心10min沉淀细胞,小心地弃去上清液,并倒转管子将残余的液体沥干。
5)将细胞悬浮在10ml冷的0.1mol/lCaCl2中,置冰上10min。
重复第4步操作,以沉淀菌体细胞。
6)收集菌体,加入1.5ml预冷的0.1mol/lCaCl2,小心悬浮,分装于200ul/管,若不马上进行转化,该感受态细胞可加入终浓度为10%的灭菌甘油,置于-70℃保存小刚论文:大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备挑取新鲜的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落接种于5ml LB培养基中,于37℃摇床培养过夜;培养物按1%接种量接种于100ml LB培养基中,37℃培养至OD600为0.5。
培养物冰上放置10分钟,然后于4℃,4000r/min 离心收集菌体(无菌离心管);将菌体用10ml冰冷的0.1M CaCl2洗一次;4℃,4000r/min 离心收集菌体,用10ml冰冷的0.1M CaCl2重悬菌体,冰浴30min;4℃,4000r/min 离心收集菌体,加入2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液,即制备成大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
质粒转化过程操作步骤(1)事先将恒温水浴的温度调到42℃。
(2)从-70℃超低温冰柜中取出一管(100μL)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5 10min。
(3)加入5–10 μL连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng),轻轻震荡后放置冰上30min。
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞,方法如下:①从野生Top10平板上挑取单菌落,接种于3ml LB液体培养基中,37℃震荡培养过夜;②以1%的接种量转接于20-40ml的LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时,将菌液置于冰浴中至少30分钟(目的:抑制大肠杆菌生长)③于4℃,4000rpm离心10分钟,弃去上清,沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L中,冰浴放置40分钟;CaCl2④4℃,4000rpm离心10分钟,弃去上清,加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl(含210%甘油)重悬细胞,以每管100-200µl分装备用。
不及时使用的各管于-80℃保存。
注:细胞重悬时动作要尽量轻柔,切忌用枪吹打。
新鲜感受态不立即使用-80度冻几小时后再用效果可能会更好(2)热激转化感受态取感受态细胞,加入外源连接产物,轻轻混匀,冰浴30分钟混合物放入42C循环水浴中,90秒-2分钟立刻转到冰浴,冷却2分钟加入900UL培养基,37温育45-60分钟10000rmp离心半分钟,弃上清,留100-200ul混匀后均匀涂在含相应抗生素的琼脂平板上,倒置平皿,37培养过夜,菌落长出。
注:转质粒加入质粒1-2ul即可,且无须加800ul培养基孵育,热击冷却后直接涂板。
原理:其原理是:细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中,细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面;经42℃短时间热休克处理,促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中,重组的基因得到表达,在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备(CaCl2)及转化方法
大肠杆菌热击感受态细胞的制备(CaCl2)及转化方法大肠杆菌热击感受态细胞的制备(CaCl2法)及转化方法感受态细胞的制备:方案一:1)从固体培养基中挑取单菌落接种于5 mL 的LB培养基中,37 ℃,200 r/min过夜活化8-10 h;2)活化的菌液按照1%转接到50 mL LB培养基中,37 ℃,200 r/min培养至OD600nm=0.4~0.6;3)4000 r/min,4℃低温收集菌体10min,轻柔弃上清;4)25 mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞,冰浴30 min;5)4000 r/min,4℃低温收集菌体10min,轻柔弃上清;6)1mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞,加1 mL预冷的50%甘油混匀,分装成每管(预冷的EP 管)100 μL,-70 ℃冻存备用;(3-6步骤均在冰上操作)方案二:1)从固体培养基中挑取单菌落接种于5 mL 的LB培养基中,37 ℃,200 r/min过夜活化8-10 h;2)活化的菌液按照1%转接到50 mL LB培养基中,37 ℃,200 r/min培养至OD600nm=0.4~0.6;3)将培养物连至锥形瓶至于冰上冰浴30min;4)4000 r/min,4℃低温收集菌体10min,轻柔弃上清;5)25 mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞,4000 r/min,4℃低温收集菌体10min,轻柔弃上清;6)1mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞,加1 mL预冷的50%甘油混匀,分装成每管(预冷的EP 管)100 μL,-70 ℃冻存备用;(3-6步骤均在冰上操作)热击转化步骤:1)在制备好的感受态细胞100 μL中,加入10 μl连接产物或1μl 质粒(依照质粒浓度而定)混匀,冰上放置30 min;2) 42 ℃温浴90 s(或者45℃温浴45 s)后迅速置入冰上1 min,加入800 μL LB培养基,37 ℃,180 r/min培养45min-1 h;3) 将孵化好的菌液涂布在相应的抗性平板上倒置,37 ℃培养过夜,PCR鉴定阳性转化子。
2010实验4,5大肠杆菌感受态的制备
克隆的筛选:
主要用不同抗生素基因筛选。常用的 抗生素有:氨苄青霉素、卡那霉素、氯 霉素、四环素、链霉素等;
三、实验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)操作步骤
1.从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落, 接种于3~5ml LB液体培养中,37℃振荡培养12h 左右,直至对数生长期。 2. 将该菌悬液以1:100~1:50转接于100ml LB液体 培养基中,37℃振荡扩大培养,当培养液开始出 现混浊后,每隔20~30min测一次OD600nm,至 OD600nm≤0.5时停止培养;
由互补产生的-半乳糖苷酶(LacZ)能够作 用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚--D- 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所以利用 这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放 入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA片段时, 会造成LacZ()基因的失活,破坏-互补作用, 就不能产生具有活性的酶。所以,有重组质粒的 菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。
IPTG配制成1000储备液,用时按培养基的量再加入);
预冷CaCl2溶液(0.1mol/L) 含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),
溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
转化的方法: 1. 化学的方法(热击法);使用化学试剂(如 CaCl)制备的感受态细胞,通过热击处理将 载体DNA分子导入受体细胞; 2. 电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的感 受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分 子导入受体细胞。
实验材料
• 受体细胞:
转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统 缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶 的突变株,常用 RM 符号表示。
氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性改变,成为允许外源DNA分子进入的状态,这种细胞称为感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。
制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油,并于-70℃保存。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC18质粒共保温,实现转化。
由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp),可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC18,则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pUC18。
转化子扩增后,可将转化的质粒提出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。
实验方法一、材料DH5a菌种(生工),3ml不含抗生素的LB液体培养基,100ml不含抗生素的LB液体培养基,盐酸,三羟甲基氨基甲烷(Tris碱),CaCl2,2块氨苄抗性LB固体培养基,2块卡纳抗性LB固体培养基,2块无抗性LB固体培养基,甘油。
二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl),50ml离心管4支,对应离心管转子,0.45um针头滤器,30ml注射器,烧杯,量筒,容量瓶,锥形瓶,冰浴。
三、试剂准备1. LB培养基300ml:胰化蛋白胨3g,酵母提取物1.5g,NaCl3g,290ml去离子水,加入10mol/L NaOH,每次5μl,比对PH试纸至PH7.0左右。
1) 分装出100ml LB液体培养基(不含抗生素)。
氯化钙法制备感受态
一、我制氯化钙法感受态的步骤:1)取大肠杆菌单菌落接种于2 ml LB液体培养基中,37 ℃200 rpm过夜培养;2)取0.5 ml菌液接种于50 ml LB液体培养基中,37 ℃200 rpm培养2。
5 h (OD600nm 介于0。
4—0。
5);3) 菌液倒入冰浴预冷的50 ml离心管中,冰浴20 min,随后利用台式冷冻离心机在4 ℃以4100 rpm转速离心10 min,弃上清,在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置1 min;4)50 ml离心管中加入30 ml冰浴预冷的0。
1 M CaCl2,涡旋振荡重悬浮细菌,冰浴30 min,4 ℃以4100 rpm转速离心10 min,弃上清,在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置片刻;5)离心管中加入2 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2,涡旋振荡重悬浮细菌,以滴管分装,滴加2滴(约100 μl)于每个1。
5 ml EP管中,冰浴放置,以备马上使用,余下加入甘油,使甘油终浓度约15%,同上分装于1。
5 ml EP管中,-20 ℃冻存(—80冰箱存更好,但咱舍不得总去开它),冻存感受态可在一周内使用(转化效率将随保存时间延长而有所下降).需要注意的是:氯化钙经常是水合物,你得看清楚你用的氯化钙水合物的分子量,然后再换算。
氯化钙溶液是过滤除菌的,使用液用前需要预冷。
另外,要是总弄不好也可以买商业化的感受态,不贵。
热激法转化大肠杆菌1)将质粒5 μl (这个不固定,根据你质粒浓度调整即可)加入到新制的感受态中,轻柔旋转EP管以混合,置冰浴30 min;2) 随后静置于42 ℃水浴90 s,之后迅速置于冰中2 min;3) 加入895 μl(凑个1ml的总体积,其实多点少点没啥的)LB液体培养基,37 ℃水浴45 min(摇床也行,但是转速要在50rpm内,太快了容易让质粒丢失);4) 将水浴后的转化菌液取200 μl滴加于含抗生素的LB琼脂板,并用涂布棒涂布均匀;6) 余下菌液以4100 rpm离心2 min,倾倒上清,以残留的培养基(~200 μl)混悬细菌,滴加于上述琼脂板,并用涂布棒涂布均匀;7)待菌液被完全吸收后,倒置培养皿,并放于37 ℃温箱过夜培养至菌落长到合适大小。
分子生物学实验2 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验大肠杆菌感受态细胞的制备实验原理:转化是将异源DNA分子引入另一细胞系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。
受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,经过CaCl2等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
经过转化的细胞在选择性培养基上,可以筛选出转化体,即带有外源DNA分子的受体细胞。
实验目的:学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞过程。
实验内容:JM109感受态细胞的制备、一、实验材料和试剂大肠杆菌JM109或DH5α,LB固体/液体培养基,0.1mol/LCaCl2溶液。
二、主要设备台式高速离心机,超净工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液器、恒温摇床,等。
三实验方法1.受体菌的培养从于37℃培养16-20小时的新鲜LB平板上挑取新活化单菌落,接种于3~5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养(300rpm)12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100~1:50(V:V)的比例接种于100ml LB液体培养基,37℃下振荡培养2~3小时至OD600=0.35~0.5左右。
2.感受态细胞的制备(1)在无菌条件下,将培养液转入预冷的1.5ml离心管中,冰上放置20min,使其停止生长。
(2)4℃下,4000rpm离心5min,弃去上清。
(3)加入0.75ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞,冰上放置30分钟,4℃下4000离心5min。
(4)弃去上清,加入0.2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞,贮存于4℃备用。
或贮存于-70℃(加10-30%的甘油),可保存半年。
四.注意事项:1、整个实验都应在无菌的条件下操作。
2、整个操作均在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率会降低。
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备感受态细胞下面的方案是Clhen等(1972)所用方法的变通方案,常用于成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克螺旋质粒DNA产生5x106-2x107个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。
该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。
该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃,但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。
1)从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm),转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约3小时(旋转摇床,300转/分)。
为得到有效转化,活细胞数不应超过108细胞/ml,可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。
在菌株与菌株之间,OD600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大,因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的OD600值,并将各浓度的增减物铺于无抗生素的LB琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数,从而使分光光度读数得到标化。
2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0℃。
切记:下述所有步骤均需无菌操作。
3)于4℃以4000转/分离心10分钟,以回收细胞。
4)倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
5)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀,放置于冰浴上。
我们发现将1mol/L CaCl2贮存液[用纯水(Mille-Q级或与其相当的级别)配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。
制备感受态细胞时,取一小份融化,用纯水稀释至100ml,用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌,然后骤冷到0℃即可。
对于大多数大肠肝菌菌株(除MC1061外),在这一步采用TFB代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。
6)于4℃以4000转/分离心10分钟,以回收细胞。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法)细胞经过一些特殊方法(电击法、CaCl2法)等处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞,即感受态细胞(Compenent cells)。
1实验方法原理:带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材:E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤:1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm),转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验,1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头(或与之相当的转头)以4 100 r/min离心10 min,以回收细胞。
4、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头(或与之相当的转头)以41 00 r/min离心10 min,以回收细胞。
7、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法).
实验仪器、材料与试剂
(一)仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 低温离心机 5. 微量取液器
(二)材料 大肠杆菌DH 5α。
Ep 管中,4℃保存备用。
(如加入
15%的甘油,-70℃保存,可保存一年)。
实验结果与讨论
感受态细胞长时间处在常温状态,会严 重影响到其转化率,损伤,操作时动作 不能剧烈。
尽量在无菌状态下操作,减少污染的可 能。
实验五 大肠杆菌感受态的制备 (CaCl2法)
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论
实验目的
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。
实验原理
用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是 限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株。
3. 菌液冰上放置10min,无菌条件下移入50ml Beckman离心管中,4℃,3,500rpm,离心 5min。
4. 弃上清,在冰浴上加入8ml预冷的无菌 CaCl2 (0.1 mol/L),轻摇使细胞悬浮。冰上放 置5min。
5. 4℃,3,500rpm离心5min。
6. 弃上清,用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L) 重新悬浮细胞,200μL/份分装到预冷的无菌
(三)试剂 1. LB液体培养基 2. 0.1mol/L CaCl2溶液
实验步骤
1. 挑取大肠杆菌DH 5α的单菌落,接种于5ml LB液体培养基中,37℃振荡培养14hr。
氯化钙法 感受态制备
氯化钙法(Calcium Chloride)本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞,所得感受态细胞可以获得5 x 106到2x 107转化克隆/微克超螺旋质粒DNA材料(MATERIALS)缓冲液和溶液(Buffers and Solutions)(冰冷的)CaCl2•2H2O (1 M)冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution, ice cold)培养基(Media)用于初始培养物培养的LB肉汤(L-broth for initial growth of culture)LB agar plates containing appropriate antibiotic核酸(Nucleic Acids)质粒DNA (Plasmid DNA)或经过重组的质粒(recombinant plasmid)方法1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。
把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中,于37°C 下振荡培养过夜。
2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时(此时细菌处于对数生长期)。
3. 室温下,4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。
弃培养基,保留细胞沉淀。
5. 加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2 溶液,并轻微打匀。
6. 4°C下,4000 rpm离心10分钟收集细胞。
7. 弃MgCl2-CaCl2溶液,保留细胞沉淀。
8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2溶液,并轻微打匀。
冰浴放置若干小时为最好。
9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作,也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。
10. 向事先灭菌,并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。
氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化[终稿]
§1 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。
二、实验原理带有外源DNA的重组质粒,在体外构建后,需要导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA,满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。
含外源DNA片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。
转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态,用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。
重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态,以便吸收外源DNA进入细菌胞内。
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术,虽然对其基本原理仍然不完全清楚,但是比较认同的看法是,细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀形成球状,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,之后细菌在富含营养的培养基上生长,球状细胞复原并分裂繁殖, 重组质粒在转化的细菌中,表达目的基因,因而在选择性培养基平板中,可以选出阳性细菌转化子。
Ca++处理的感受态细胞,一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA愈小,转化率愈高。
环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。
除外,电击法也可用于转化过程,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依赖短暂的电击,促使DNA进入细菌。
转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。
电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。
为了转化成功,本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”,可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤,直接进行转化。
三、仪器与试剂1.隔水式电热恒温培养箱,水浴锅,台式冷冻恒温振荡器,低温离心机,净化工作台。
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氯化钙法制备感受态细胞
下面的方案是Clhen等(1972)所用方法的变通方案,常用于成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克螺旋质粒DNA产生5x106-2x107个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。
该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。
该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃,但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。
1)从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm),转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约3小时(旋转摇床,300转/分)。
为得到有效转化,活细胞数不应超过108细胞/ml,可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。
在菌株与菌株之间,OD600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大,因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的OD600值,并将各浓度的增减物铺于无抗生素的LB琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数,从而使分光光度读数得到标化。
2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0℃。
切记:下述所有步骤均需无菌操作。
3)于4℃以4000转/分离心10分钟,以回收细胞。
4)倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
5)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀,放置于冰浴上。
我们发现将1mol/L CaCl2贮存液[用纯水(Mille-Q级或与其相当的级
别)配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。
制备感受态细胞时,取一小份融化,用纯水稀释至100ml,用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌,然后骤冷到0℃即可。
对于大多数大肠肝菌菌株(除MC1061外),在这一步采用TFB代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。
6)于4℃以4000转/分离心10分钟,以回收细胞。
7)倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2或TFB重悬每份细胞沉淀。
此时,可将细胞分成小份,放于-70℃冻存[加DMSO保存感受态细胞的方法与步骤:每4ml感受态细胞加0。
75mlDMSO冰上放置10min再分装放入-70℃冰箱]。
在这些条件下,尽管长期保存后转化效率会稍有下降,但细胞仍可保持处于感受态。
Dagert和Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48小时,在贮存的最初12-24小时内,转化效率增加3-5倍,然后降低到初始水平。
9)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA(体积∞10μl,DNA∞50ng),轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30分钟。
10)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管回上,恰恰放置90秒,不要摇动试管。
11)快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1-2分钟。
12)每管加800μlSOC培养基。
用水溶将培养基加温至37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45分钟细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
如果要求更高的转化效率,在复苏期中,应温和地摇
动细胞(转速不超过225转/分)。
13)将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相应抗生素的SOB琼脂培养基上。
如培养物体积太小(〈10μl)。
可再加肉汤培养基,用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。
如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞,应离心浓缩细胞,然后用适量SOC轻轻重悬细胞。
如用四环素抗性作为选择标记,全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上(或铺在软琼脂中)。
然而如选用氨苄青霉素抗性,则只能将一部分培养物(根据实验决定)铺在单独的平皿上。
氨苄青霉素抗性功的增加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系,这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长掏物质的缘故。
14)将平板置于室温直至液体被吸收。
15)倒置平皿,于37℃培养,12-16小时后可出现菌落。
如检查氨苄青霉素抗性,用转化细胞铺增板时密度较低(每个90mm平板不超过104菌落),于37℃培养平板时不应超过20小时。
氨苄青霉素抗性的转化可将β-内酰胺酶分泌到培养基中,迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。
这样,铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。
在选择培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素,以及将抗生素浓度从60μg/ml增至100μg/ml,可使情况有所改善,但不能彻底根除之。