感受态几种制备方法及效率比较
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1. 感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(compete nee)。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一一种短暂的感受态以摄取外源DNA感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法(CaCb法)、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2. 感受态细胞做得不好的原因一.菌液0D直偏大或偏小二.原始菌株不好三.试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度, 尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600 来控制.DH5 a菌株OD600为时细胞密度是5X 107/ml ）;2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2 处理的细胞, 在低温条件下, 一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24 小时达到最高, 之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4. 化合物及无机离子的影响：在Ca2啲基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5. 所使用的器皿必须干净. 迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6. 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7. 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；4.为何要低温环境制备在制备过程中, 细胞膜通透性增大而变得脆弱, 低温能提高感受态细胞存活率. 所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20 C保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1.感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2.感受态细胞做得不好的原因一．菌液OD值偏大或偏小二．原始菌株不好三．试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经 CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）；5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；7．一定范围内,转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；4．为何要低温环境制备在制备过程中,细胞膜通透性增大而变得脆弱,低温能提高感受态细胞存活率.所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20℃保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备及各种感受态的特点Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法：1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃，220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于50ml LB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养小时至OD600=。
注意：接种比例不得大于1:10。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置5~10min；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃ 5000g离心5分钟。
用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃ 5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等5、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g 离心5分钟；6、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。
分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。
含15%甘油的L CaCl2制备方法:称取 CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源DNA的状态。
感受态细胞的特征：（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。
大肠杆菌感受态细胞制备和转化
DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于
细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收
DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温
一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如
卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物
涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，
即可获得细菌菌落。
④ 涂平板: 将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含
Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基
吸收后，37℃倒置培养皿培养12~18h。 2
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分 子实
1
生验
0
物
学
注意：
1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的 LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入 Kana储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后到 平板；
细胞膜的通透性发生暂时性改变, 成为能允许外源 DNA
分子进入的细胞, 称感受态细胞。
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转化
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入 受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
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实验九，十
大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化
一.实验原理
1.概念 感受态细胞
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移
到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种
转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另
一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,
需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后,
大肠杆菌感受态
大肠杆菌感受态大肠杆菌感受态细胞的制备和转化概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
本实验室一般用TSS 法制备感受态。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。
5。
注意:接种比例不得大于1:１0。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃５000g离心５分钟。
用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。
分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。
含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。
28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。
感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。
感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。
(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。
感受态细胞制备原理
感受态细胞制备原理
原理：
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。
此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
转化效率可达106-107转化子/微克DNA。
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。
操作：
1、取-70℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜。
2、第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）
3、当菌落600nm OD值达到时，将烧瓶取出放置冰上10~15分钟。
在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。
4℃，4000g离心10分钟。
4、弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。
加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。
5、4℃，4000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。
加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体。
每管分装，至4℃保存备用，24-48小时内使用效果较好。
如果暂时不用，可再保存于-70℃的低温冰箱中。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
感受态细胞的制备原理是通过刺激细胞或组织，使其产生特定的感受态反应。
下面将介绍两种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 免疫刺激法：免疫刺激是一种常见的制备感受态细胞的方法。
它通过注射外源性抗原或感兴趣的抗原到实验动物体内，刺激其免疫系统产生针对该抗原的免疫应答。
随后，从动物体内获得淋巴细胞或单个免疫细胞，并进行分离和培养。
在适当的刺激条件下，这些细胞会分化为感受态细胞，表达特定的受体和效应分子。
2. 细胞诱导法：细胞诱导法是一种将一种细胞类型转化为另一种感受态细胞的方法。
通过适当的生理或外部信号，诱导细胞发生转变，从而获得感受态细胞。
例如，通过改变细胞培养基的成分和配比，或添加特定的生长因子和信号分子，可以使一些细胞从一种特定状态转变为特定的感受态细胞。
而在实现这些方法时，需要注意实验条件的细节，确保刺激物的浓度和持续时间、培养基的组分和条件等都符合特定的要求。
此外，在实验过程中需要使用适当的实验技术和方法对细胞进行监测和鉴定，确保制备得到的是目标感受态细胞。
感受态制备
制备高效率感受态的方法液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.在18度150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB 溶液悬浮, 在冷10分钟再次离心回收菌体用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.在液氮或-80度保存.TB溶液*TRANSFORMA TION BUFFERPIPES 3.0G 10mMCaCl2.2H2O 2.2g 15mMKCl 18.6g 250mMadd water up to 950ml用5N KOH 调PH至6.7-6.8*低PH不溶在加终浓度未55mM的MnCl2.4H2O 10.9g定溶到1升, 过滤灭菌, 4度保存.但有人提出, 冻存后转化效率降低, 且这种方法不适合大质粒.（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。
（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。
（3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
（4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
（5）重复第4步操作。
（6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。
（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。
本法效率极高,建议大家采纳1. 单菌落-------2ml LB 37度120RPM过夜------1%转接-------37度200RPM2小时(OD到0.4~0.5)2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。
浅谈大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
取－ ８０℃冻 存 的 质 粒 克 隆 菌 株 如 （ Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－ Ｂｌｕｅ 株） ， 不加抗生素 ３７℃ ２００ｒ／ｍｉｎ 摇床摇菌过夜； 次日取 ４５ｕｌ 复苏的 ＸＬ１－ Ｂｌｕｅ 菌液， 加到 ４ ｍｌ 不含 抗生素的 ＬＢ 培养基（ Ｌｕｒｉａ－ Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉｕｍ） 中， ２００ ｒ／ｍｉｎ 摇床摇菌 ２～３ｈ， 至 ＯＤ６００ 值约 ０．４； 分别取 １．５ｍｌ 菌液加入到 １．５ｍｌ ＥＰ 管中， 冰上放置 １０ｍｉｎ； ４℃， １２０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １ｍｉｎ， 以回收细胞， 倒置 ＥＰ 管 流尽残液， 每管加 ３００ｕｌ 冰预冷的 ０．１ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２， 重悬沉淀细菌， 冰上放置 １０ｍｉｎ； ４℃， １２０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １ｍｉｎ， 倒置 ＥＰ 管流尽残液， 每管加 ３００ｕｌ 冰预冷 的 ０．１ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２， 重悬细胞， 冰上放置 １０ｍｉｎ； ５ｕｌ 连接物加 ２００ｕｌ 感受态细胞， 冰上放置 ３０ｍｉｎ； ４２℃ ９０ｓｅｃ， 立即冰上放置 １～２ｍｉｎ； 加 ８００ｕｌ ＳＯＣ， ３７℃缓 慢摇菌 １ｈ， 使细菌复苏， 并且表达质粒编码的抗生 素抗性标记基因； 将适当体积已转化的感受态细胞 转 移 到 含 ２００ｍｍｏｌ／ｕｌ ＭｇＳＯ４ 和 相 应 抗 生 素 的 ＳＯＢ 培养基上。将平板置于室温至液体被吸收， 倒置平 皿， 于 ３７℃培养， １２～１６ｈ 后可出现菌落。
TOP10感受态制作方法
TOP 10 感受态细胞制备SOB培养基成分每升成分∙0.5% (w/v) 酵母提取物∙2% (w/v) 胰蛋白胨∙10 mM NaCl∙ 2.5 mM KCl∙20 mM MgSO4∙ 5 g酵母提取物∙20 g胰蛋白胨∙0.584 g NaCl ∙0.186 g KCl∙ 2.4 g MgSO4备注：可以用10 mM MgCl2 and 10 mM MgSO4代替20 mM MgSO4。
高压前调pH至7.5。
放入4℃待用。
CCMB80 buffer 每升成分∙10 mM KAc pH 7.0 (10 ml of a 1M stock/L) 0.98g∙80 mM CaCl2.2H2O (11.8 g/L) 11.8g∙20 mM MnCl2.4H2O (4.0 g/L) 4.0g∙10 mM MgCl2.6H2O (2.0 g/L) 2.0g∙10% 甘油(100 ml/L) 100ml备注：用0.1N HCl调pH至6.4（pH过高会使锰离子变成二氧化锰沉淀）。
无菌过滤后在4℃保存待用。
轻微的深色沉淀不影响其使用效果。
步骤：1.把TOP 10菌种接种至固体LB培养基中37℃过夜培养12 h。
2.挑取大小适当菌落至含10ml LB液体培养基的50 ml玻璃瓶中，置于37 ℃恒温摇床中过夜培养（摇床速度不可过慢，应让菌与空气、营养充分结合，以190左右为宜）。
12 h后观察培养液情况，可适当加长培养时间，但不可过久，因为感受态细菌传代越年轻越好。
3.吸取50μl菌液至于250 ml 配置好的SOB培养基中，至于37℃恒温摇床中培养。
开始时每30 min观察一次，以后每10 min观察一次。
当OD600值为0.3时（轻轻摇荡锥形瓶可见轻微云雾状混浊）立即取出把整个液体置于冰盒的冰面以下冷却待用。
4.将要使用的离心管、buffer在使用前均需置于冰上中降温待用。
无菌操作台、移液枪等在实用前均需用紫外消毒、酒精擦拭干净。
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。
取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。
感受态制备和电转化,多种感受态
一、金黄色葡萄球菌感受态制备1、平板上挑单菌落于TSB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml 培养基培养2h，OD600=0.4-0.53、2个50ml管冰上预冷，4℃将培养的菌分装2个50ml管中，5000rpm离心6-8min，去上清。
4、加10ml 0.5M蔗糖，打散菌体，再加40ml 0.5M蔗糖混匀，5000rpm离心5min，去上清。
5、重复4 .6、再重复4，但加到50ml 0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm离心5min，去上清。
7、用600ul 0.5M蔗糖垂悬。
8、分装菌液，每管100ul。
9、液氮冷冻10s，存于-80℃。
二、大肠杆菌感受态1、平板上挑单菌落于LB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml LB培养液体基培养2h（用50ml管），到OD600=0.4-0.6。
3、冰浴10min。
4、4℃5000rpm离心5min，去上清。
5、加30ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
6、2 ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
7、分装每管100ul，存于-80℃。
三、超级感受态（一）溶液1、TB （1L）终浓度MnCl2-4H20 10.88g 55mmol/lCaCl2 1.665g 15mmol/lKCl 18.65g 250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph 6.7) 20ml 10mmol/lH2O 补至1L0.45um 过滤除菌1、PIPES(0.5mol/l,ph 6.7),哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES),≥99.5% 英文名称：Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid1.5g PIPES溶于80ml水，5mol/l，KOH调Ph=6.7，定容100ml。
TOP10感受态制作方法
TOP 10 感受态细胞制备SOB培养基成分每升成分∙0.5% (w/v) 酵母提取物∙2% (w/v) 胰蛋白胨∙10 mM NaCl∙ 2.5 mM KCl∙20 mM MgSO4∙ 5 g酵母提取物∙20 g胰蛋白胨∙0.584 g NaCl ∙0.186 g KCl∙ 2.4 g MgSO4备注：可以用10 mM MgCl2and 10 mM MgSO4代替20 mM MgSO4。
高压前调pH至7.5。
放入4℃待用。
CCMB80 buffer 每升成分∙10 mM KOAc pH 7.0 (10 ml of a 1M stock/L) 0.98g∙80 mM CaCl2.2H2O (11.8 g/L) 11.8g∙20 mM MnCl2.4H2O (4.0 g/L) 4.0g∙10 mM MgCl2.6H2O (2.0 g/L) 2.0g∙10% 甘油(100 ml/L) 100ml备注：用0.1N HCl调pH至6.4（pH过高会使锰离子变成二氧化锰沉淀）。
无菌过滤后在4℃保存待用。
轻微的深色沉淀不影响其使用效果。
步骤：1.把TOP 10菌种接种至固体LB培养基中37℃过夜培养12 h。
2.挑取大小适当菌落至含10ml LB液体培养基的50 ml玻璃瓶中，置于37 ℃恒温摇床中过夜培养（摇床速度不可过慢，应让菌与空气、营养充分结合，以190左右为宜）。
12 h后观察培养液情况，可适当加长培养时间，但不可过久，因为感受态细菌传代越年轻越好。
3.吸取50μl菌液至于250 ml 配置好的SOB培养基中，至于37℃恒温摇床中培养。
开始时每30 min观察一次，以后每10 min观察一次。
当OD600值为0.3时（轻轻摇荡锥形瓶可见轻微云雾状混浊）立即取出把整个液体置于冰盒的冰面以下冷却待用。
4.将要使用的离心管、buffer在使用前均需置于冰上中降温待用。
无菌操作台、移液枪等在实用前均需用紫外消毒、酒精擦拭干净。
感受态制备
1、在制备过程中，细胞膜通透性增大而变得脆弱，低温能提高感受态细胞 存活率。所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡。 2、实验溶剂的温度、离心时的温度、缓冲液的温度都要保持低温。
器皿洁净：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip
头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被 其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
感受态细胞的制备及转化
小飞蝗
感受态细胞
所谓感受态，即指受体最易接受外源DNA片段并实现 其转化的一种生理状态。
转化
转化：细胞通过摄取外源遗传物质而发生遗传学改变的过程。 受体菌只有处在感受态时才能够摄取转化因子。
应用
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞使 之无性繁殖或者高效表达外源基因，它是微生物遗传、分子 遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
8）沉淀缓悬于初始菌液体积1/12.5的TB溶液中，冰浴10min；
9）加入7% 终体积的DMSO，逐滴加入且边加边慢摇； 10）冰浴10min，以0.1mL/管分装于预冷的eppendorf管中；
11）液氮速冻，-80oC贮存，在半年内使用。
三、电击转化
电击法: 使用瞬时高压电（数千伏特）处理细胞悬液，微生 物细胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中 溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部。 特点:做电击转化时，悬液中有近70%的细胞会因电击而死亡， 但转化效率很高。
二、超级感受态细胞的制备
感受态细胞制作
方法七：Inoue法制备超级感受态细胞越干净越好，越冷越好。
1、将洗干净的瓶子（500ml三角烧瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小时，倒去烧瓶中的水并将烧瓶倒扣在吸水纸上2-3分钟。
用Milli-Q水配置250ml LB液体培养基。
高压灭菌。
2、准备两盒1.5ml EP管，每盒中放置两张吸水纸，共约两百个。
高压灭菌。
3、于早晨7-8点钟小摇菌种，挑取单菌落于5ml Milli-Q水配置且灭菌的LB液体培养基（无抗性）中，37℃培养12小时以上（OD600大于1.5）。
可以用一个新的50ml 进口离心管（costa，BD等品牌都可以）来摇细菌。
4、晚上10点钟左右，按1：100大摇细菌。
超静台内吸取2.5ml小摇细菌于高压灭菌的250ml SOB培养基（无抗性）中，18-22℃，200rpm摇过夜。
5、第二天上午测量细菌OD600值。
Top10, JM109等生长速度快的细菌约在上午9点左右OD600达到0.55左右，DH5α则要到下午4-6点钟（可以多摇几瓶细菌，梯度接菌，如1：50，1：100，1：200等）。
6、将OD600达到0.55的细菌置于冰上10min（OD600在0.4-0.8之间都可以，对结果影响不大）。
7、4℃，4000rpm（2500g），10min集菌（用新的50ml 进口离心管）。
8、超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上，大力向下击打，尽可能去掉剩余SOB(LB)。
9、每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。
在冰上来回滑动重悬细菌（重悬的时间与向下击打的力度和来回滑动的速度相关，这两者与感受态效率没有直接关系）。
10、超静台内向每管倒入约30ml 预冷的Inoue转化缓冲液，来回颠倒混匀，冰上10min。
11、4℃，4000rpm，10min集菌。
12、超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上（换一张吧，别用刚才那张），大力向下击打，尽可能去掉剩余缓冲液。
感受态几种制备方法及效率比较
感受态(2011-04-14 10:45:00)转载▼标签：杂谈方法一A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。
将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。
取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。
无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。
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感受态
(2011-04-14 10:45:00)
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杂谈
方法一
A液：1M，MnCl2：
B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；
C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。
将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。
取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。
无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。
对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。
现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到1010，但是操作起来比较麻烦。
要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。
根据实验室的实际情况，我们将其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有许多可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。
1、所用器具的洁净程度。
这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。
2、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，
是有氧还是无氧生长。
厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。
建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培养基的pH值。
这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。
一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。
这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培养后的OD值。
其实这并一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。
同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。
5、培养基中的各种离子。
经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对
较高。
在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。
6、培养温度。
文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。
7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。
8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。
至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。
方法二
1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.
2.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶或80毫升/1升锥形瓶的SOB 培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.
3.在18度150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度.
4.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟
5. 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体
6.去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟
7.再次离心回收菌体
8.用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟
9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.
10.在液氮或-80度保存.
（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。
（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。
（3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
（4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
（5）重复第4步操作。
（6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。
（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。
本法效率极高,建议大家采纳
1. 单菌落-------2ml LB 37度120RPM过夜------1%转接-------37度200RPM2小时(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min
建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。
以下为转贴，具体方法请最好查阅文献。
E.coli感受态细胞制备方法:
单菌落平板至2ml LB, 37℃250 r/m, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至A600
=0.2-0.4
离心后用10毫升TSS重悬后,分装-70oC保存。
尽量冰上操作.
转化: 加质粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42℃90秒，冰上2分钟，加LB至1ml , 37℃1小时后铺抗生素平板。
TSS:
7.0ml pH6.1 LB
2.0ml 50% PEG6000
0.5ML dmso
0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)
0.3ml ddH2O。