实验新人必读(六)：外泌体实验研究的正确打开姿势!
外泌体研究方案的正确打开方式
外泌体研究方案的正确打开方式啥是外泌体？外泌体（Exosome）是一种由活细胞分泌的圆形（dish）或杯状（cup）脂质双分子层膜微小囊泡，直径约30-100nm，可由各种类型的细胞分泌，广泛存在于血液、尿液、唾液、滑膜液、乳汁、脑脊液、眼泪、腹水、羊水等各种体液以及细胞培养上清中。
外泌体是一种活性复合体，包含复杂的蛋白质，核酸和脂质。
最常见的外泌体蛋白组成包括膜转运和融合相关蛋白、多囊泡胞内体产生相关蛋白，（Alix, TSG101等）、分子伴侣（HSP70,HSP90）、整合素和四跨膜蛋白超家族（CD63,CD9,CD81, CD82等），这些成分反映了其生物起源。
外泌体还富含胆固醇、鞘脂、神经酰胺、糖脂GM3和含长饱和脂肪酰基的甘油磷脂链。
外泌体的起源外泌体的前身含有一个秘密武器，叫泛素化蛋白，被ESCRT（转运必需内体分选复合物）识别，形成内腔囊泡（ILVs），进一步形成膜性囊泡（MVBs），其中一部分会被降解为溶酶体，当MVBs与细胞膜发生融合后这些小囊泡可被释放到细胞外空间，称为外泌体。
外泌体生物功能2013年，美国科学家James E. Rothman, Randy W. Schekman 和德国科学家Thomas C. Sudhof因细胞囊泡运输的调节机制而荣获当年诺贝尔生理学或医学奖。
研究表明：外泌体有携带与运输功能，随着体液循环到达全身各个部位，通过与受体细胞的质膜保持稳定结合或经由内吞途径被内化，释放出外泌体中的内容物。
外泌体与靶细胞融合后，靶细胞的生物学特性可以在基因水平（外泌体RNA）转录水平（外泌体miRNA）或在蛋白水平发生改变，从而实现细胞间通信。
这些相互作用可能导致有益（如增强免疫状态）或有害（如扩散发病）的结果。
外泌体分离纯化方法外泌体鉴定方法NTA鉴定纳米颗粒跟踪分析（Nanopraticle Tracking Analysis, NTA）技术可以对10-2000nm范围内的纳米颗粒进行快速实时动态检测，测量参数包括颗粒粒径、散射光强、浓度等，可对外泌体进行粒径大小及数量进行统计并做出初步质量评估。
外泌体（Exosome）知识与检测方法
外泌体（Exosome）知识与检测方法一、 Exosome 简介最近几年，一种叫做Exosome的小囊泡正受到大家广泛的关注。
Exosome是直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。
Exosome天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌体(Exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。
Exosome在30年前被人们所发现。
早期的研究认为，exosome 执行蛋白运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。
直到2007年，研究人员发现exosome也运输核酸，参与细胞间通讯。
总之，其蛋白、RNA和脂肪成分特异，且携带了一些重要的信号分子，有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用，这使得exosome的市场也在快速扩展，并成为热门的研究对象。
不同组织细胞来源exosome由于携带的蛋白质不同，而能够发挥不同的生物学功能。
例如，肿瘤细胞分泌的exosome能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸；而树突状细胞源性exosome则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。
目前研究发现，Exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且exosome能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故exosome有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。
Exosome携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。
前者可能与exosome的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的exosome，而这些特定细胞源的exosome与其生物学功能有着密切联系，例如分子来源的Exosome上含有MHCII类分子。
二， Exosome 提取Exosome是由活细胞分泌的，它是一种亚细胞成分，组要成分是磷脂双分子和携带的膜性分子，其界定依据形态学和生物化学及提取方式不同细胞源的exosome是不同的，这些不同的理化性质有利于exosome的提取。
外泌体纳米流式检测法实验步骤
外泌体纳米流式检测法实验步骤嘿，咱今儿就来聊聊外泌体纳米流式检测法的实验步骤哈！
你想想，这外泌体就像是一个个小宝贝，咱得小心翼翼地把它们找出来，测清楚。
那怎么找呢？这就好比咱要在一堆沙子里找出那些特别的小珍珠一样。
首先啊，咱得准备好样本，这就像是给小珍珠们搭好了舞台。
样本可得处理得妥妥当当的，不能有啥马虎。
然后呢，就是标记啦！这就好像给小珍珠们贴上标签，让咱能一下子就认出它们来。
这标记可得选对了，不然可就找不到咱要的那些小宝贝啦。
接下来，就是流式检测这一关键步骤咯！这就像是给小珍珠们过安检一样，一个一个地看过去，把它们的各种信息都给弄清楚。
你说这是不是很神奇呀？
在检测的时候，咱可得瞪大眼睛，仔细瞧着，不能放过任何一个细节。
这就跟警察抓小偷似的，得把每个线索都抓住。
检测完了，那数据可得好好分析分析。
这就像咱把找到的小珍珠分类整理，看看哪些是特别珍贵的，哪些是比较普通的。
哎呀，你说这外泌体纳米流式检测法是不是挺有意思的呀？就这么
一步步地，把那些小小的外泌体给弄清楚了。
这可不是随便谁都能做
好的哟，得有耐心，还得细心。
你想想，如果不仔细，那不是把重要的小珍珠给弄丢啦？那可不行！咱得像爱护宝贝一样对待这个实验。
总之呢，外泌体纳米流式检测法的实验步骤就像是一场有趣的冒险，每一步都充满了挑战和惊喜。
咱得好好去探索，去发现，才能真正掌
握这个厉害的技术呀！你准备好了吗？和我一起去探索这个奇妙的外
泌体世界吧！。
收藏外泌体鉴定外泌体示踪方法，你都知道吗？
收藏外泌体鉴定外泌体示踪方法，你都知道吗？（一）外泌体鉴定方法外泌体内容物 (芯片、测序、质谱、WB、QPCR、流式等方法)Gutierrez-Vazquez, C., et al.ImmunolRev, 2013. 251(1): p. 125-42.蛋白组分：细胞骨架蛋白、信号转导相关蛋白、代谢酶类、抗原结合提呈相关蛋白典型的Exosomes标记蛋白有：四跨膜蛋白超家族，如CD9、CD63、CD81等；细胞质蛋白，如肌动蛋白(actin)、钙磷脂结合蛋白(annexins)；参与生物功能的分子，如凋亡转接基因2互作蛋白X(ALIX)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、热休克蛋白(HSP70、HSP90)；整合素等。
Exosomes还含有细胞类型特异的标记蛋白，这种蛋白分子由分泌Exosomes的细胞所决定；核酸组分：Exosomes内还能够包裹mRNA、miRNA、lncRNA、mtDNA、circRNA，并转移至其它细胞中发挥生物学作用，Exosomes所包裹的内容物也是细胞类型特异的。
1、蛋白质-WB鉴定Journalof Extracellular Vesicles 2015, 4: 27032、蛋白质- ELISA鉴定Journalof Histochemistry & Cytochemistry 2015, Vol. 63(3) 181-1893、蛋白质-流式细胞术鉴定doi:10.1038/nature223414、蛋白质-质谱鉴定Methods in Molecular Biology,vol. 15455、RNA-RNA提取Molecular Immunology 50(2012) 278–2866、RNA-测序鉴定PLoSOne. 2016; 11(1): e0146353.7、纳米颗粒跟踪分析：纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle TrackingAnalysis ，NTA）是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，结合Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。
外泌体要怎么来研究？
外泌体要怎么来研究？外泌体是不是很火？其实外泌体之前我也给大家讲过哦，只是估计你们没好好看而已。
其实外泌体可以理解为细胞排泄出来的代谢产物，后来才发现，有点作用的。
外泌体研究到底复不复杂呢？其实不复杂。
早在2014年的时候，J Extracell Vesicles上就发表了一篇外泌体研究指南：不要觉得这个指南过期了哈，其实一直到现在都还是有价值的，这篇蚊帐提到了大致两点：1）外泌体的研究，首先要证明外泌体存在2）要证明外泌体的功能证明外泌体存在，就需要用电镜和蛋白marker双重证明，当然他们也举了点蛋白Marker的栗子：那功能呢，就需要使得外泌体被荧光标记后，被吞入靶细胞的证明，然后验证靶细胞的变化。
其实就这么简单，我们可以举个外泌体蚊帐的栗子，下面这篇蚊帐发表在Cellular Physiology and Biochemistry（和OT一样被踢去前还有五分多，当然，不要在意这些细节，因为这篇蚊帐发的时候还是有IF的）上：这主要做的是乳腺癌外泌体里包含的一个miRNA的功能作用，首先他们证明了有外泌体的存在，电镜&蛋白Marker（外泌体存在√）：接着说明了一下这个miRNA在乳腺癌中高表达（所以才会被分泌出去对别的细胞产生影响），而正常乳腺细胞中低表达：接着他们给miRNA做了Fam荧光标记，然后分离出了外泌体，这时候外泌体有荧光了。
然后将分离出来的外泌体和正常乳腺细胞一起培养，发现外泌体和miRNA被吞了进去（外泌体被吞√），然后正常乳腺细胞的增殖啊、耐药啊等等功能都变了（外泌体功能√）：最后用最直接的miRNA功能研究（也就是对靶基因的蛋白翻译）做了个验证：全文完……其实我们不难发现，外泌体的研究指南里，已经给我们阐明了最基本的外泌体研究的关键步骤。
步骤和思路都不难，难的是实验实在是有点小难度，别说分离了，还带荧光去让靶细胞胞吞，估计只有做这些实验的人才能感同身受吧，好了，今天就先策到这里吧，想要看看。
外泌体的鉴定宝典
外泌体的鉴定宝典上一期为大家介绍了外泌体常用的提取方法（点击进入查看），今天继续为大家介绍外泌体的鉴定。
外泌体参与神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能。
细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，由于它们含有丰富的生物标志物，可用于监测疾病进展，治疗反应等，同时由于外泌体具有携带递送生物分子的功能，具有成为临床药物递送载体的潜力。
外泌体的功能研究第一步，即进行外泌体的鉴定。
鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定外泌体的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征以及直径，对其进行区分鉴定。
1WB验证：检测外泌体标志蛋白的表达情况外泌体形成于早期胞内体，在内吞体转运复合体（ESCRT）及一些相关蛋白的调控下，早期胞内体发生内出芽形成多个腔内小囊泡，构成多胞体（MVB），MVB 最后在GTPase家族中的RAB酶调解下与细胞膜融合向外界释放囊泡。
wode外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63、CD81和CD9)）、热休克蛋白家族（(HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-II(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。
其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常用到的细胞外囊泡标志物。
这些标志物蛋白其实主要是涉及到了囊泡的形成和分泌过程，他们产生于细胞中，定位于胞内的膜结构附近，如四旋蛋白（CD9，CD63和CD81），直接参与了细胞外囊泡内容物的分选；TSG101是ESCRT复合体相关的蛋白，而ESCRT复合体是膜形成和断裂的驱动器。
ALIX直接涉及到了膜泡在形成过程中切割脱离质膜形成独立膜结构的过程。
可选实验操作步骤：（1）超离后获得外泌体，加入PBS重悬或者加入蛋白裂解液（若外泌体量小，加入裂解液后可省略离心取上清步骤）。
外泌体操作流程及注意事项
外泌体操作流程及注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!外泌体是一种由细胞分泌的微小囊泡，直径约为 30-150nm，具有多种生物学功能，如细胞间通讯、免疫调节、肿瘤转移等。
外泌体研究ppt课件
现
随后，许多研究均发现外泌
与 体可通过携带蛋白质及核酸等成 分在细胞间传递信息并发挥功能。
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外
泌
研 究
体 的 发
现
与
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细 胞 内 由 多 囊 泡 胞 内 体 (multivesicular bodies, MVBs)向外出芽形成, 通过MVBs与细
总
结
外泌体作为具有生物学功能的小囊泡内容物丰富、稳 定性高，具有一定的组织特异性，是近年肿瘤研究领域关 注的热点。
充分认识并利用外泌体的特点优势，筛选并发现新型 标志物，有望克服肿瘤异质性等难题，在肿瘤早期诊断、 治疗、监测与预后评价等方面将具有重要的临床意义。
外泌体有望作为一种药物载体，在肿瘤治疗方面可能 具有巨大的开发潜能。
特
表面标记蛋白主要有 Alix，TSG101，CD63，CD9，CD81和 HSP70。主要含有以下几种
物质：MHC I 类和/或 II 类分子、热休克蛋白（hsp）、四跨膜蛋白、整合素、细胞骨架
征 蛋白以及一些生物酶类。
被认为是细胞间分子交换和信息传递的生物纳米颗粒。
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人体中大约有1014个外泌体，近乎于平均每个细胞产生
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外泌体却并没有因为初次被发现而被引起重视，反而被误认 为是细胞处理胞内垃圾的一种囊泡外泌形式，用于装载和运送细
泌
胞在成熟过程中所产生的诸如质膜受体一类的废弃物。 1996年, Raposo等人发现
外泌体正规操作方法
外泌体正规操作方法
外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是一类具有膜包裹的细胞外体，可以通过分泌进入细胞外液。
以下是外泌体的正规操作方法：
1. 细胞培养和外泌体收集：
- 选择适合外泌体比较丰富的细胞系，如癌细胞系等。
- 使用含有足够营养物质的培养基进行培养，在细胞生长到80-90%的密度时进行收集外泌体。
2. 细胞外泌体的分离和富集：
- 低速离心：对细胞上清和培养基进行低速离心，将细胞碎片和大颗粒物质沉淀。
- 高速离心：将低速离心上清进行高速离心，以沉淀分离出外泌体。
- 滤膜过滤：可以使用0.2至0.8微米的滤膜，通过滤膜将外泌体分离出来。
3. 外泌体的纯化和浓缩：
- 过滤：使用0.2至0.45微米的滤膜，将外泌体悬液过滤以去除细胞碎片和大颗粒物质，得到纯化的外泌体。
- 超速离心：将外泌体悬液进行超速离心，将外泌体沉淀。
- 液氮冷冻：将外泌体悬液进行液氮冻结保存，以便后续分析或实验操作。
4. 外泌体的鉴定和表征：
- 电镜观察：使用透射电子显微镜观察外泌体形态和结构。
- 免疫学鉴定：使用外泌体表面标记物的抗体进行免疫学检测，如CD63、CD81等。
- 蛋白质分析：使用质谱分析等方法对外泌体中的蛋白质进行分析。
需要注意的是，在操作过程中应避免外泌体的污染和损伤，同时应遵循生物安全操作规范。
外泌体鉴定安全操作及保养规程
外泌体鉴定安全操作及保养规程外泌体（Extracellular Vesicles, EVs）是一种通过分泌方式由细胞释放到体外的膜包囊泡，是一种重要的细胞间通讯与信息传递方式。
在生物医学领域，外泌体的应用前景非常广阔，包括药物递送、诊断与治疗等方面。
在外泌体应用研究中，安全操作和保养极为重要，能够有效防止样品受到污染和损伤，确保实验结果的可靠性。
一、外泌体基本结构和分类外泌体是一种通过细胞分泌方式形成的可透过细胞膜的小膜包囊，主要由膜脂与一些膜蛋白、核酸、糖脂和其他生物分子组成。
通过外泌体，细胞能够向周围环境释放生物分子，同时也能够吸收周围细胞的外泌体。
根据其来源及特征，外泌体可分为三类：1.外泌体（exosomes）：直径约30-100 nm，是细胞内由内质网形成的膜包囊，含有细胞膜蛋白、编码和非编码RNA、糖脂等多种分子，广泛存在于人体内的各种细胞中，是研究应用最为广泛的外泌体类型之一。
2.微囊泡（microvesicles）：直径约100-1000 nm，是由细胞膜向外翻转形成的膜包囊，含有细胞膜、表面蛋白等多种分子，通常来源于某些特殊类型的细胞如血小板、植物细胞等。
3.神经突触囊泡（synaptic vesicles）：直径约30-50 nm，主要存在于神经系统中，是细胞释放化学信号物质的包囊，含有神经递质、膜蛋白、核酸等多种分子。
二、外泌体鉴定的常用技术外泌体鉴定常用的技术主要有电子显微镜（EM）、动态光散射（DLS）、纳米粒子追踪分析（NTA）等。
其中，EM技术需要特殊训练的技术专家进行操作，并且需要较高的成本和较长的实验周期，适用于一些对外泌体质量有高要求的场合。
DLS和NTA则是比较简便、快速的手段，能够给出外泌体的直径、多法术散射指数等参考参数。
在外泌体鉴定过程中，需要注意以下几点：1.操作前需准备好所有所需设备和试剂，并检查是否齐全、没有过期、没有损坏。
2.样品的制备需要注意避免细胞破裂、污染等影响结果的因素，需遵循相应的标准操作规程。
干细胞外泌体研究套路
干细胞外泌体研究套路
干细胞外泌体研究是指对干细胞分泌的细胞外囊泡、蛋白质、RNA和代谢产物等进行深入研究的领域。
下面是干细胞外泌
体研究的一般套路：
1. 筛选合适的干细胞类型：根据研究目的，选择适合的干细胞类型，如造血干细胞、间充质干细胞等。
2. 干细胞培养条件优化：通过优化培养基成分、培养温度和气体条件等，使干细胞的生长和分泌能力达到最佳状态。
3. 提取干细胞外泌体：采用各种方法，如超速离心、滤膜、纳米技术等，将培养液中的干细胞外泌体进行提取。
4. 干细胞外泌体的分离和纯化：采用不同的分离和纯化技术，如凝胶过滤、差凝、超速离心等，使得干细胞外泌体得到高纯度的分离。
5. 外泌体的鉴定和表征：通过电子显微镜观察外泌体的形态，使用质谱分析、蛋白质组学和基因组学等技术，鉴定并分析外泌体中的蛋白质、RNA和代谢产物等成分。
6. 外泌体的功能研究：通过体外实验、动物模型等，探究外泌体对细胞增殖、分化、迁移、凋亡等生物学过程的影响，以及其在组织修复和疾病治疗中的应用潜力。
7. 机制研究：利用细胞信号传导、分子生物学、遗传学等技术，
研究外泌体分泌的调控机制，从而深入了解干细胞外泌体的产生与功能。
以上是干细胞外泌体研究的一般套路，具体研究方法和步骤可能会因具体实验目的和设备条件而有所不同。
科普小讲堂：外泌体专题
科普小讲堂：外泌体专题外泌体的基本信息：1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”，即外泌体。
人体几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带多种蛋白质、mRNA、miRNA和脂质类物质等，作为重要的传递信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，可参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。
外泌体与微泡：我们知道，细胞间相互作用可以通过释放蛋白质、核酸、脂质等分子到胞外与受体结合从而介导胞内细胞传导。
除此之外，细胞还可以释放膜囊泡，外泌体与微泡就是其中两种，二者相似但形成方式不同：外泌体是细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中的膜囊泡，而微泡则是细胞出芽与细胞膜融合后直接脱落形成的囊泡，且外泌体大小均一，直径在40~100 nm，其大小取决于其起源部位以及细胞中的脂质双层结构；而微泡大小不一，直径在50 ~1000 nm之间。
外泌体的组成：外泌体主要含有融合蛋白和转运蛋白、热休克蛋白(HSP 70)、CD类蛋白以及磷脂酶和其他脂质相关蛋白，但是不同来源的外泌体的组成有差异。
外泌体的提取方式：1、离心法：此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足。
2、过滤离心：这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样纯度不足。
3、密度梯度离心法：用此种方法分离到的外泌体纯度较高，但是前期准备工作繁杂4、免疫磁珠法：这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单，但生理性盐浓度会影响外泌体生物活性。
5、色谱法：此种方法分离出的外泌体大小均一，但设备特殊，应用不广泛。
外泌体的生物学功能：1、首次报道的外泌体生物功能是红血球成熟过程中排出来的蛋白质。
2、进一步的研究表明其功能包括排泄不必要的蛋白质和RNA等物质。
3、可促进生物体免疫应答反应。
4、对凝血和血管生成其促进作用。
外泌体提取和鉴定
外泌体提取和鉴定外泌体是一种由细胞分泌的微小囊泡，直径通常在 30 150 纳米之间。
它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。
因此，外泌体的提取和鉴定成为了生物医学研究中的关键技术。
外泌体的提取方法多种多样，常见的包括超速离心法、超滤法、免疫亲和捕获法、沉淀法等。
超速离心法是外泌体提取的经典方法。
其基本原理是利用不同的离心速度和时间，逐步去除细胞碎片、大囊泡和其他杂质，最终获得较为纯净的外泌体。
这个过程通常需要多次离心，操作较为繁琐，且需要昂贵的超速离心机设备。
但它的优点是能够获得较高纯度的外泌体。
超滤法是基于膜孔径的大小来分离外泌体。
通过选择合适孔径的超滤膜，可以让小分子物质和溶剂通过，而将外泌体截留在膜上。
这种方法相对简单快捷，但外泌体的纯度可能不如超速离心法。
免疫亲和捕获法是利用抗体与外泌体表面特异性抗原的结合来实现分离。
这种方法具有较高的特异性和选择性，但抗体的成本较高，且可能存在非特异性结合的问题。
沉淀法是通过加入特定的试剂，如聚乙二醇（PEG），使外泌体从溶液中沉淀下来。
该方法操作简便，但获得的外泌体可能会含有较多的杂质。
在实际应用中，选择哪种提取方法取决于实验的需求和条件。
如果需要高纯度的外泌体进行深入的机制研究，超速离心法可能是较好的选择；如果是大规模的样本处理或者对纯度要求不是特别高，沉淀法或超滤法可能更为合适。
提取到外泌体之后，接下来就是鉴定。
外泌体的鉴定通常包括形态学观察、粒径分析、标志物检测等方面。
形态学观察可以通过电子显微镜技术，如透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。
TEM 能够清晰地显示外泌体的形态、大小和结构；SEM 则可以提供外泌体的表面特征。
通过电镜观察，可以看到外泌体呈现为具有典型双层膜结构的圆形或椭圆形小囊泡。
粒径分析常用的技术是纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）。
NTA 可以通过追踪单个颗粒的布朗运动来测量外泌体的粒径分布和浓度；DLS 则是基于散射光强度的波动来计算粒径。
外泌体研发流程
外泌体研发流程全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：外泌体是一种细胞外囊泡，在细胞内的内质网、高尔基体或细胞膜上形成，包裹有细胞中的蛋白质、核酸、脂质和其他生物分子。
外泌体通过释放这些物质，可以在细胞间进行信息传递和调控细胞功能。
研究表明，外泌体在多种疾病的发生和发展中扮演着重要的作用，如癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等。
外泌体的研究和应用成为了科研领域热点之一。
外泌体的研发流程是一个系统性的过程，需要经历多个阶段，包括外泌体的提取、纯化、表征和应用等步骤。
下面将详细介绍外泌体研发流程的各个环节。
1. 外泌体的提取外泌体的提取是外泌体研发流程中的第一步。
外泌体可以来源于多种细胞类型，如肿瘤细胞、干细胞、免疫细胞等。
一般来说，细胞培养后，收集细胞培养上清液（细胞培养液），离心沉淀，去除细胞碎片和大颗粒物质，得到含有外泌体的上清液。
然后可以通过超速离心、超滤、密度梯度离心等方法进行外泌体的提取和富集。
2. 外泌体的纯化外泌体提取后，需要进行纯化步骤以去除杂质和提高外泌体的纯度。
目前常用的方法包括超滤、凝胶渗透层析、亲和层析、离子交换层析等。
超滤是最常用的方法，通过不同孔径的滤膜，可以将外泌体与大分子物质分离开来。
凝胶渗透层析则是利用外泌体在介质中的分子大小差异进行分离。
3. 外泌体的表征外泌体的表征是外泌体研发过程中的关键环节，可以通过多种方法对外泌体的形态、大小、组成等进行分析。
电子显微镜是观察外泌体形态和大小的常用方法，可以直观地显示外泌体的外观。
动态光散射仪（DLS）可以测量外泌体的粒径分布，帮助确定外泌体的大小范围。
质谱分析可以对外泌体中的蛋白质和核酸成分进行鉴定和定量分析。
4. 外泌体的应用外泌体具有多种生物学功能，可以用于基础研究、临床医学和生物工程领域。
外泌体可以作为载体用于递送药物、基因和蛋白质，具有较好的生物稳定性和细胞内渗透性。
外泌体也可以用于诊断性外泌体标志物的鉴定和检测，在癌症早期诊断和预后判断方面具有潜在应用价值。
外泌体流式细胞术检测步骤
外泌体流式细胞术检测步骤嘿，你要是对细胞研究感兴趣的话，那外泌体流式细胞术可真是个超酷的话题呢！今天我就来给你讲讲这外泌体流式细胞术检测步骤，保证让你听得明明白白的。
外泌体啊，就像是细胞派出的一个个小信使。
那我们怎么用流式细胞术这个厉害的工具来检测它们呢？第一步，样本的采集和准备。
这就像是要准备好食材才能做菜一样重要。
我们得从合适的细胞培养物或者生物体液中获取样本。
要是从细胞培养物来，就得小心地收集培养液。
我有个朋友，刚开始做这个的时候，特别马虎，培养液收集的时候都不小心洒了一些，可把他急坏了，直喊“哎呀，这可咋整”。
这时候就得重新再做一些前期的培养工作，多麻烦啊。
所以收集的时候一定要小心谨慎。
对于生物体液，像血液、尿液之类的，采集的时候也要按照标准的操作流程来，不然样本有问题，后面检测都是白搭。
样本采集好之后呢，我们要对样本进行预处理。
这一步就像是给外泌体来个大扫除，把那些杂质什么的都去掉。
我们可能会用到超速离心法。
这就好比是用一个超级强大的筛子，把外泌体从一堆东西里筛出来。
不过这个超速离心可不好操作，转速啊、时间啊都得拿捏得死死的。
我曾经见过实验室里的两个小伙伴为了超速离心的参数差点吵起来。
一个说“我觉得这个转速得再高点”，另一个就反驳“你可拉倒吧，太高了外泌体结构都可能被破坏了”。
最后还是得参考很多文献，反复试验才确定了合适的参数。
接下来就是标记外泌体啦。
这可是个精细活，就像给每个小信使贴上不同的标签一样。
我们可以用一些特异性的抗体来标记外泌体表面的标志物。
这个过程就像是给每个外泌体穿上一件有特色的衣服，这样流式细胞仪就能识别它们了。
但是这抗体的选择可得慎重啊。
要是选错了，那就好比给外泌体穿错了衣服，流式细胞仪可就不认识它们了。
我记得有次一个新手在实验室，选抗体的时候没仔细看说明书，结果标记出来的结果乱七八糟的，他自己都懵了，自言自语道“这怎么和我想象的完全不一样呢？”标记好之后，就可以把样本放到流式细胞仪里面去检测了。
外泌体提取的具体步骤及方法
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡（30-150nm），现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。
其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
现已证实可以分泌外泌体的细胞有：肥大细胞、淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞等。
外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。
同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。
1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。
多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。
其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。
有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。
外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。
由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。
外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。
据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离：1.超速离心法（差速离心）超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。
外泌体鉴定安全操作及保养规程
外泌体鉴定安全操作及保养规程一、实验室安全操作规程：1.实验前，实验人员应了解相关实验操作的流程和所需试剂的性质及使用方法，并掌握实验室安全知识。
2.实验者应佩戴实验服、防护眼镜、手套等个人防护装备，避免直接接触有害物质。
3.实验前应检查实验设备的完整性与安全性，确保无损坏和泄漏现象。
4.实验前，应对工作台面进行彻底清洁，并保持清洁环境。
5.实验中，不得任意摸动实验设备和容器，以免造成污染和事故。
6.实验过程中，应注意试剂的使用方法和注意事项，严禁超标使用试剂。
7.实验者应根据操作手册进行实验，严格按照实验步骤进行操作，不得随意更改实验操作。
8.实验人员要做好实验记录，详细记录实验操作步骤、使用试剂和实验结果等信息。
9.实验后，应及时清理和消毒实验设备和工作区域，保持整洁和无菌环境。
二、外泌体鉴定保养规程：1.实验设备：1.1外泌体鉴定仪器应定期进行检测和维护，确保仪器的正常使用。
1.2使用前应对仪器进行内外部的清洁。
2.試學設施：2.1存放外泌体鉴定试剂和标本的冰箱应定期清洁和消毒，杜绝交叉污染。
2.2温度计和各种试剂瓶子应检查保存状态，如有损坏及时更换。
3.外泌体鉴定试剂：3.1外泌体鉴定试剂应根据使用频率和有效期进行分类储存。
3.2使用前应查看试剂品牌和有效期，并注意试剂的稳定性和保存方法。
4.试剂容器：4.1使用前应检查各种试剂容器的完整性和干净度，如有破损或污染应更换。
4.2用完的试剂容器要及时清洗干净并存放在规定处。
5.实验室环境：5.1实验区域应保持干净整洁，并定期进行消毒。
5.2实验室应定期清洁排水管道，避免堵塞和污染。
6.实验记录：6.1实验记录应详细记录实验操作的信息、结果和观察等，有助于后续数据分析和归档。
6.2实验记录应遵循实验室记录的规范，如采用电子记录需备份和存档。
7.试剂储存：7.1试剂应分类储存，按照温度和环境要求进行保存。
7.2高危试剂应单独存放，避免与其他试剂混淆。
外泌体机的操作方法
外泌体机的操作方法外泌体是细胞释放的一种膜包裹的小颗粒，含有多种生物活性物质，可以通过近年来的研究发现，外泌体在各种生物体中扮演着重要的角色，不仅在细胞间的信息传递中发挥作用，也在多种生理和病理过程中参与调控。
鉴于外泌体的重要性，科学家们开始对外泌体进行研究，并开发了外泌体分离和操作的多种方法。
以下是外泌体的分离和操作方法的一些例子：1. 不需过滤的离心法：这种方法是最常用的分离外泌体的方法之一。
具体步骤如下：a) 采集培养液或体液：外泌体可以从各种细胞培养液（如细胞培养上清液）或体液中分离得到，比如血浆或尿液。
b) 离心培养液或体液：使用不同的离心速度和时间进行离心，以去除细胞碎片和大颗粒物质。
一般情况下，离心速度为2000-3000×g，离心时间为10-30分钟。
c) 涡旋离心上清液：用涡旋将上清液涡旋离心，反复离心3-5次，离心速度为15000-20000×g，离心时间为10分钟，以去除大颗粒物质。
d) 超高速离心：将涡旋离心上清液转移到超高速离心管中，离心速度为100000×g以上，离心时间为1-2小时，以沉淀外泌体。
沉淀后的外泌体可以用PBS 等缓冲液进行洗涤。
2. 过滤法：这种方法适用于外泌体较大（直径大于200 nm）的情况下。
具体步骤如下：a) 采集培养液或体液：同上。
b) 使用过滤膜：选择合适孔径的过滤膜（一般为0.22-0.45微米）进行过滤，以去除细胞碎片和大颗粒物质。
c) 洗涤和浓缩：将过滤液通过管滤器或超滤器进行洗涤和浓缩，得到外泌体。
3. 密度梯度离心法：这种方法主要通过利用外泌体和其他物质的密度差异进行分离。
具体步骤如下：a) 采集培养液或体液：同上。
b) 离心培养液或体液：使用较低的离心速度对细胞碎片和大颗粒物质进行离心。
c) 超高速离心：将离心上清液转移到离子梯度离心管中，加入适量的密度梯度溶液，如葡萄糖或乳糖，并将其放入超高速离心机中进行离心。
实验新人必读（六）：外泌体实验研究的正确打开姿势！
实验新人必读（六）：外泌体实验研究的正确打开姿势！作者：解螺旋.子非鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手导语最近，外泌体在科研界以迅雷不及掩耳之势火了起来，国自然中标量那是翻着倍的蹭蹭往上涨。
然而目前外泌体的研究仍处于初级阶段，首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法，其次对其他囊泡与外泌体的区别仍不能做出清楚的判断。
外泌体的藏身之处正所谓高手在民间，欲一睹高人风采，就必先找到高人隐身之处。
通常外泌体藏身于细胞上清、血液、尿液、脑脊液和其他体液。
血液血液离心后有两种形式：血清和血浆，但不少小伙伴对它们傻傻分不清楚。
前者是不经抗凝处理的血液会自动在一系列凝血因子的作用下发生凝集，离心后的上层液体；后者是经抗凝剂处理后，离心出去血细胞所得液体。
两者虽然一母同胞，但显然血浆比血清更有内涵，其包含一些纤维蛋白原以及大量的外泌体，因而血浆也更受广大研究者的青睐。
Tips:1）血样抗凝剂花样繁多，科研汪们一不小心就会跌的鼻青脸肿。
肝素除了会抑制PCR外，还可与外泌体结合阻止细胞摄取外泌体；双嘧达莫（CTAD）则会阻止血小板的激活并抑制其释放外泌体；EDTA可能会干扰PCR反应（尽管其程度小于肝素），但是还是优于其他选择。
2）抽血时动作要轻柔迅速，并记录准确的抽血时间。
因为外泌体在抽血后30分钟内是稳定的，时间过长血小板会因种种物理因素而被激活并释放外泌体，导致外泌体数量增加。
尿液尿液中的外泌体性质稳定且RNA含量高于尿液中的细胞内的RNA。
而收集尿液时，应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液，并注意避免细菌污染。
受试者的亲属（性别相同、年龄相仿）可作为对照。
同时也要注意对饮食的控制。
脑脊液脑脊液中的外泌体含量虽然较其他体液如血液少，但可作为神经系统疾病的潜在生物标志物。
采集脑脊液时避免受到血液污染，一般由于健康对照脑脊液获取困难，往往以其他神经异常的患者为对照。
外泌体的通缉之法既然已经找到了外泌体的藏身之处，接下来就是请高手出山了。
解锁外泌体外泌体样本收集
解锁外泌体外泌体样本收集外泌体是由细胞分泌的纳米级膜性小囊泡，直径约30~150nm。
外泌体来源多样，广泛存在并分布于各种生物液体中，富含来源细胞的蛋白质、脂质和核酸，参与细胞间的信息交流。
不同病理和生理条件下，外泌体的内容物不尽相同，因此外泌体可以很好地反映生物体的疾病与健康状态。
此外，外泌体特殊的膜结构能够保护其内容物如RNA（microRNA、mRNA、lncRNA、circRNA）免受酶的降解，保证其能在各类体液中被稳定检测到，因此外泌体是研究各种疾病的良好生物学材料，可作为肿瘤潜在的biomarker和治疗靶点，亦可作为基因/药物的递送载体，在疾病的诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。
图1 外泌体的形成与分泌据统计，2019年国自然中标的外泌体相关项目总计600多项，总金额高达2.5亿，相较2018年，总金额增长了44.5%，足可见外泌体研究的火热程度。
近几年，随着高通量检测技术的飞速发展，对外泌体进行组学研究极大地推动了外泌体的研究进展。
伯豪生物致力于科研服务，拥有高标准的样品处理平台、微阵列芯片平台、高通量测序平台、生物标志物平台、生物信息分析平台等多个平台，能够实现外泌体分离、鉴定、内含物（蛋白质、mRNA、ncRNA）检测及验证的“一站式”外泌体研究服务。
那么如何开展外泌体研究，第一步也是相当重要的一步就是收集外泌体含量高的样本。
外泌体存在于各种生物体液中，如血液、乳汁、尿液，脑脊液，那么如何有效的收集各种类型的样本用于后续的外泌体分离呢，下面我们来简单介绍下各类型外泌体样本的具体收集方法。
图2 外泌体的来源及内含物血清注意：收集血清样本时一定不能加入抗凝剂。
1) 采集外周血（建议早晨空腹抽血），迅速转入不含EDTA的试管中，涡旋或颠倒混合5～10 次；2) 室温（22℃~25℃）下静置30分钟，或4℃下静置3~4小时，可见血块自行凝固；3) 吸取上清至新的离心管中，4℃，8200×g离心10分钟；4) 吸取上清至新的离心管中，4℃，16000×g离心10分钟；5) 小心吸取上清至新的离心管中（1.5ml离心管，每管不超过1ml）， -80℃保存；6）干冰寄送样本。
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实验新人必读（六）：外泌体实验研究的正确打开姿势！
导语最近，外泌体在科研界以迅雷不及掩耳之势火了起来，国自然中标量那是翻着倍的蹭蹭往上涨。
然而目前外泌体的研究仍处于初级阶段，首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法，其次对其他囊泡与外泌体的区别仍不能做出清楚的判断。
外泌体的藏身之处正所谓高手在民间，欲一睹高人风采，就必先找到高人隐身之处。
通常外泌体藏身于细胞上清、血液、尿液、脑脊液和其他体液。
血液血液离心后有两种形式：血清和血浆，但不少小伙伴对它们傻傻分不清楚。
前者是不经抗凝处理的血液会自动在一系列凝血因子的作用下发生凝集，离心后的上层液体；后者是经抗凝剂处理后，离心出去血细胞所得液体。
两者虽然一母同胞，但显然血浆比血清更有内涵，其包含一些纤维蛋白原以及大量的外泌体，因而血浆也更受广大研究者的青睐。
Tips:1）血样抗凝剂花样繁多，科研汪们一不小心就会跌的鼻青脸肿。
肝素除了会抑制PCR外，还可与外泌体结合阻止细胞摄取外泌体；双嘧达莫（CTAD）则会阻止血小板的激活并抑制其释放外泌体；EDTA可能会干扰PCR反应（尽管其程度小于肝素），但是还是优于其他选择。
2）抽血时动作要轻柔迅速，并记录准确的抽血时间。
因为
外泌体在抽血后30分钟内是稳定的，时间过长血小板会因种种物理因素而被激活并释放外泌体，导致外泌体数量增加。
尿液尿液中的外泌体性质稳定且RNA含量高于尿液中的细胞内的RNA。
而收集尿液时，应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液，并注意避免细菌污染。
受试者的亲属（性别相同、年龄相仿）可作为对照。
同时也要注意对饮食的控制。
脑脊液脑脊液中的外泌体含量虽然较其他体液如血液少，但可作为神经系统疾病的潜在生物标志物。
采集脑脊液时避免受到血液污染，一般由于健康对照脑脊液获取困难，往往以其他神经异常的患者为对照。
外泌体的通缉之法既然已经找到了外泌体的藏身之处，接下来就是请高手出山了。
正常情况下外泌体是有侠义之风的，默默无闻的传递信号分子，以激活下游信号通路，帮助其他细胞各司其职。
比如树突状细胞源性的外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。
然而一旦细胞变坏了，其分泌的外泌体也就成了恐怖份子，像肿瘤细胞分泌的外泌体小哥就作恶多端，在机体中掀起了一片腥风血雨，引得科研界中的各路人马纷纷亮出自家法宝对其进行缉拿通缉。
秘笈一：超速离心法此秘笈普遍被科研者所接受，通常与蔗糖密度梯度结合，使相对低密度的外泌体漂浮起来。
然而，此法比较耗时耗力，一般需要8-30h，一次仅能处理6个样品，且产率较低，不适用于如血浆和血清等粘性生物液
体。
然而却可以获得高纯度的外泌体，并且这种方法在过去10年里已经被很多实验室成功应用于外泌体的分离。
秘笈二：按照尺寸大小分离外泌体BiooScientific的ExoMir 试剂盒通过两步超滤法就成功分离纯化外泌体。
第一个微型过滤器基本上能去除所有细胞、血小板和细胞碎片，第二个微型过滤器可用正压力来获取所有直径大于30nm的囊泡。
该方法以HPLC（高效液相层析）为基础的方法有可能获得高纯度的外泌体，但是这个过程需要专用设备。
秘笈三：外泌体沉淀聚乙二醇（PEGs）通常被用于病毒和其他小颗粒的沉淀。
基于此，System Biosciences 提供的ExoQuick试剂在被加入体液中后，离心即可沉淀外泌体。
同时，Life Technologies也开发了五种Total Exosome Isolation试剂，能使低溶解度的成分（如外泌体）析出，然后通过低速离心收集外泌体。
秘笈四：基于亲和力获得外泌体外泌体相关抗原的抗体（如抗CD63、CD9、Alix、CD81、CD82、annexin、EpCAM和Rab5抗体）可以用作分离外泌体的特异性标记，用包被此类物质的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，可达到外泌体吸附分离的目的。
该方法可保证外泌体形态的完整性，且特异性高、操作简单，但非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不利于下一步实验，且不适合大量样本。
秘笈五：qEV法该方法是利用Size Exclusion
Chromatography(SEC)的原理对外泌体进行分离纯化的分离柱，在不损伤外泌体活性的情况下，有效去除样品中杂质蛋白和脂类。
如此可获得高纯度的外泌体，且快速简单，成本低廉。
适合于细胞上清、血液、尿液等体液的外泌体分离。
一般建议与qNano测量法联合使用，qNano可利用“可控电阻脉冲传感技术”对外泌体的浓度和尺寸进行快速准确的测量，因此qEV+qNano被视为快速准确的分离和测定外泌体的最佳解决方案。
外泌体的分析研究既然已经捕获了“做坏事”的外泌体，就该拷问它所携带的货物中哪些是与某种疾病息息相关的。
一般而言，外泌体里含有蛋白质和非编码RNA。
因而，其分析研究可分为以下几类。
首先要外泌体进行鉴定，通常研究者可用透射电镜观察外泌体的结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球型），再结合免疫标记就可清楚的分析特定指标在外泌体表达的部位。
为了让大家对外泌体有着一个更直观的感受，先奉上一个经典的外泌体电镜图，由图中可看到很多略小于100nm的具有清晰膜的茶托样结构，小图中则显示附在膜结构表面的免疫胶体金。
对外泌体验明正身之后，就可以在蛋白水平和核酸水平对其进行深入分析。
1.蛋白水平的分析
（1）SDS-PAGE：通过SDS-PAGE电泳可以分析得到的外泌体中蛋白的含量及种类。
（2）Western-Blot：通过Western-Blot可以检测外泌体中特定的蛋白表达情况。
（3）2-DE等蛋白组学分析：可以了解外泌体中不同蛋白的表达、数量情况
2.基因水平的分析
（1）Real-Time PCR：通过PCR可以分析需要研究的指标的表达量。
（2）转录组分析：通过测序或者芯片，分析Exosome不同基因的转录水平。
（3）miRNA ：通过测序或者芯片，检测与Exosome相关的miRNA的表达情况，研究特定的miRNA。
（4）lncRNA分析：通过测序或者芯片，检测与Exosome 相关的lncRNA的表达情况，研究特定的lncRNA与Exosome共同调控某种疾病的关系。
Tips:
1）由于外泌体内含有大量小片段RNA，测序时会测到许多非miRNA的小片段RNA，造成有效数据不足。
一般建议使用芯片的方法检测外泌体miRNA。
2）lncRNA表达丰度较低，在外泌体中丰度更低，对于低丰度基因，芯片测准确性远远大于测序。
所以建议使用基因芯片的方法检测外泌体lncRNA。
3）为了获取漂亮的测序或芯片结果，外泌体的含量是关
键。
不同样本提取外泌体得率不同，根据经验：3ml以上的血浆血清可得到约30-50ng的RNA；30ml以上细胞上清可得到约70-100ng以上的RNA；其他类型的体液与其性质有关，建议都以30mL以上。