VERO细胞复苏标准操作规程

VERO细胞复苏标准操作规程

1、目的：明确细胞复苏的操作规程及注意事项，使该细胞复苏规范化，标准化。

2、范围：适用于轮状病毒减毒活疫苗（细胞源）细胞复苏岗位。

3、责任者：轮状病毒减毒活疫苗细胞复苏岗位操作人员；QA 人员。

4、设备、试剂和材料

4.1设备：

细胞培养箱、生物安全柜、倒置光学显微镜、电热恒温水温箱、标化的温度计、防护眼C0

2

镜和手套

4.2、试剂：

非洲绿猴肾VERO细胞母细胞1支(？代)、IMDM培养基、新生牛血清（小牛或胎牛？）、碳酸氢钠溶液、双抗、20%胎牛血清IMDM细胞复苏液（PH7.2)60ml。

4.3材料：

灭菌移液管（1ml、 2ml、 5ml、10ml）各两支、灭菌细胞培养瓶（T175？）5个、方瓶栓、培养架、75%酒精棉、橡胶吸头、灭菌翻帽塞、酒精灯、镊子（止血钳）.

5.1、准备

5.1.1、文件准备

工作记录、标签

5.1.2、操作前准备

（1）区域准备：无不相关人员在场。

（2）人员准备：称量时操作人员须双人复核。

（3）仪器设备准备：仪器设备正常，需要预热的先预热。

（4）原材料准备：试剂及物品齐全，在效期内且合格。

（5）将复苏液放置37℃水浴预热？时间。

5.2操作

5.2.1 佩戴眼镜和手套，操作者用镊子将要复苏的细胞冻存管从液氮罐中取出。迅速放入37℃水浴，用镊子夹住细胞冻存管，轻摇使其急速融化，30～60s内完成。

5.2.2 将融化好的细胞冻存管用75％酒精擦拭消毒。

5.2.3 按照1：2分种两个T175方瓶中，首先抽取60ml复苏液放入一个T175瓶中。

5.2.4 无菌下取出细胞。取2ml吸管在60ml复苏液中抽取至少1.5ml在打回去，再抽取少

量复苏液轻轻打入冻存管中，同时轻摇冻存管，并轻轻反复吹打几下，抽取冻存细胞加至60ml复苏液中，再抽取少量液体加入冻存管中，将剩余细胞抽到60ml复苏液中，轻摇混匀，抽取30ml液体分种另一T175中，并量剩余液体，保证两瓶复苏液量相等。

5.2.5 轻摇后，置37℃，5％C02孵箱静置培养，次日更换一次培养液（10%细胞生长液），继续培养，观察生长情况。

6、注意事项

6.1 整个操作过程都需在无菌条件下进行，严防污染。

6.2 将细胞从液氮罐中取出时要带手套或用镊子，以防冻伤。

6.3 冻存和复苏最好用新配制的培养液。

培训

培训部门：轮状疫苗实验室

培训对象：复苏岗位操作人员

培训时间：1小时