荧光偏振分析方法

§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米材料
与蛋白质和核酸相比，纳米材料具有良好的热稳定性、更大的质量 和体积且易于合成和进行表面修饰，因此用纳米材料增强荧光偏振具有 潜在的应用价值。
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米粒子显著增大了分子相互作用的荧光偏振值变化
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
金纳米颗粒、硅纳米颗粒等虽然能有效增强荧光偏振值，但是 探针与纳米颗粒需要复杂的共价连接；
开发一种普适、简单的荧光偏振增强剂仍然是一个重要的任务。
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米材料的生物功能化方法
非共价功能化途径
静电相互作用 π-π堆积作用 范德华力
0.2 ppb
DNA-DNA System
Quantitative Analysis
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
DNAzyme自组装荧光偏振探针
MAP探针
Anal. Biochem. 2010, 401, 47-52.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米二氧化硅颗粒增强荧光偏振探针
第6章 荧光偏振分析方法
1 2
传统荧光偏振技术及发展情况概述
纳米增强荧光偏振一般策略及应用
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 光的偏振性
非偏振光原理图
自然光在各 个方向 振动是均匀分布的
偏振光原理图
一束 光 线 都 在 同 一 方向上振动
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
（Fluorescence Polarization，FP）
荧光偏振
100% 0%
<100%
>0%
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
如何衡量：偏振值的定义
P=
-
+
r=
-
+
2

偏振值一般以mP（毫偏）来表示
对于完全偏振发射，P = r = 1；对于自然光，P = r = 0
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 偏振值的影响参数
分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例，分子旋转弛豫时间是分子转过 68.5度角时所用的时间； 分子旋转弛豫时间与介质黏度、绝对温度、分子体积和分子重量和气体常 数有关。
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
非竞争法检测小分子化合物
空间构象变化
Anal. Chem. 2009, 81, 7468-7473.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
磷酸二酯酶I介导的荧光偏振传感平台
Anal. Bioanal. Chem. 2011, 401, 3229-3234.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法
Biosensors and Bioelectronics, 2014, 54, 285-291.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法
百度文库
Chem. Asian J. 2014, 9, 87-92.
核酸适配体 (aptamer) 是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质、小分子、 金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修饰、稳定性好、成 本低，已广泛应用于分析应用领域
传统分子量依赖性FA用于研究蛋白质-核酸相互作用的原理
Biosens. Bioelectron. 2012, 32, 148-154.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 荧光偏振分析的一般步骤
• • 利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前 后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。 如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高。如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振 光值低，从而计算出样品的偏振值（偏振值单位 mP）。 通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。
汞离子检测荧光偏振探针检测限达到 0.2 ppb， 比传统荧光偏振方法提高 3 个数量级，检测时间 只需20分钟，具有良好的特异性
MAP探针
Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8386-8389.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
AuNP-DNA System
AuNP Enhancement
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
蛋白质增强荧光偏振
小分子检测
单 链 结 合 蛋 白 SSBP (Single-strand binding proteins）
Anal. Chem. 2012, 84, 7203-7211.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
特殊结构核酸增强荧光偏振
碳基纳米材料：石墨烯，碳纳米管，碳纳米颗粒等
与DNA发生π-π堆积作用 与多肽发生π-π静电作用等
ssDNA/dsDNA 与碳基纳米材 料之间的相互作用差别悬殊
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法
Chem. Commun. 2013, 49, 1942-1944.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
国内外研究现状及发展动态分析
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1. 荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析法 (fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 是一种定量免疫分析技术。
荧光偏振免疫分析原理
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。 如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性； 如果被激发的荧光物质处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发 光的偏振特性，也就是所谓的荧光去偏振现象。 Polarized excitation
Chem. Commun. 2012, 48, 7480-7482.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
核酸酶检测及药物筛选
Chem. Commun. 2011, 47, 4763-4765.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
基于链置换反应开发的纳米金颗粒增强荧光偏振探针
Biosensors and Bioelectronics, 2013, 41, 569-575.
1. 荧光偏振免疫分析
近年来， FPIA 备受生物、化学、医学专家们的亲睐，有关 FPIA 在临床化 学、农药残留分析、食品安全、环境监测中应用的报道逐年增加，成为生化分 析和环境监测中强有力的工具。
优点：均相分析无需分离、迅速、灵敏、无放射性污染、重现性高；
缺点：FPIA不如酶联免疫吸附测定(ELISA)灵敏，且荧光标记物可能会与样 本中的基质特异性结合，使荧光偏振值增加，产生一定干扰。
离子检测
K+的作用
一. 调节机体和细胞的渗透压 二. 调节体液的酸碱平衡 三. 参与体内蛋白质和糖类的代谢 四. 维持正常的神经兴奋性和心肌运动
Analyst, 2012, 137, 2770-2773.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
特殊结构核酸增强荧光偏振
离子和小分子检测
Chem. Commun. 2014,50, 2049-2051.
1 1 1 1 RT ( )(1 ) P 3 P0 3 V
偏振值衡量荧光分子的运动性
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
20世纪50年代Weber进一步拓展了荧光偏振理论并首次将荧光偏振用于生化 分析领域。
20世纪80年代，随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化，荧光偏振技术在 生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色。
•
荧光偏振技术的优势:
荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是 不生成有害的放射性废物) 并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光 偏振是真正均相的，允许实时检测 (动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均 相检测形式 (中间不含洗涤步骤 ) 的最佳解决方案。
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 常用的测试仪器及配件
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法
“signal-off”
“signal-on”
Anal. Chem. 2013, 85, 1424-1430.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米颗粒增强荧光偏振信号分析方法
Materials Science and Engineering C 2014, 38, 206-211.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
2. 蛋白质-核酸相互作用
蛋白质与核酸的相互作用是许多生命活动的重要部分，因此成为分子生物 学研究的一个热点
荧光偏振技术为研究蛋白质 -核酸 相互作用提供了一个免分离、免 放射性的途径
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
2. 蛋白质-核酸相互作用
MAP探针 (Mass Amplifying Probe)
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
蛋白质增强荧光偏振
核酸检测
Anal. Chem. 1995, 67, 3945-3951.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
蛋白质增强荧光偏振
小分子检测
凝血酶 (thrombin)
Anal. Chem. 2012, 84, 5535-5541.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
多元检测方法
Chem. Commun. 2012, 48, 10004–10006.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
传统荧光偏振分析技术面临的挑战： 荧光偏振变化量较小，灵敏度较低
解决的方案
1 1 1 1 RT ( )(1 ) P 3 P0 3 V
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
3. 核酸分析
超灵敏检测DNA
改进传统的荧光偏振检测方 法，通过引入酶促反应扩增检测 信号应用于超灵敏检测特异性 DNA的检测。
Chem. Commun. 2011, 47, 3478-3480.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
3. 核酸分析
实时监测DNA双链的形成和解链过程
Nucleic Acids Res. 2003, 31: e70.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
4. 水解酶催化反应
实时监测蛋白酶催化过程
• 蛋白酶对机体的新陈代谢 和生物调控起到非常重要 的作用；
蛋白酶酶活的评估有助于 理解特定的生化途径、开 发治疗药物。
•
Chem. Rev. 2010, 110, 2685-2708.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米球形聚电解质刷增强荧光偏振信号分析方法
ChemBioChem 2010, 11, 494-497.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
二氧化钛纳米棒增强荧光偏振信号分析方法
Acta Chim. Sinica 2013, 71, 1620-1624.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
T4 polynucleotide kinase activity and inhibition
J. Mater. Chem. B, 2013, 1, 2018-2021.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
聚乙烯纳米颗粒增强荧光偏振信号放大分析方法
Chem. Asian J. 2014, 9, 2755-2760.